وقتی صحبت از تفاوت ژنتیکی میکنیم یا اینکه فردی ژن A را دارد یا ندارد ! در واقع صحبت از بودن یا نبودن ژن نیست. چون هر ژن اهمیت و نقش ویژه خود را داشته و حذف یا غیر فعال شدن یک ژن تاثیرات شدیدی بر سلامتی دارد که منجر به بیماری های ژنتیکی شدید و پیچیده میشود. در صحبت از تفاوت ژنتیکی، تفاوت های ما بسیار کوچک و در حد تک نوکلئوتید ها است. همه ما به خوبی میدانیم که رشته DNA از ترکیب و توالی های 4 باز عالی A و T و C و G ساخته شده و این زبان 4 حرفی کل حیات موجودات را ایجاد کرده.
تصور کنید یک رشته بلند DNA که دارای میلیاردها حرف از این چهار باز است، در هر سلول بدن ما قرار دارد. حال، تفاوتهای ژنتیکی که در مورد آن صحبت میکنیم، عمدتاً به تغییرات یا جهشهای کوچکی در این حروف مربوط میشوند. برای مثال، ممکن است در یک نقطه خاص از این رشته، به جای حرف “A”، حرف “G” قرار گرفته باشد. این تفاوتهای کوچک، که به آنها پلی مورفیسم تک نوکلئوتیدی یا (SNP) میگوییم، میتوانند نقش مهمی در ویژگیهای منحصر به فرد ما ایفا کنند.
اگر تا به حال تست میکرواری ژنوتایپینگ داده باشید نتایج شما به صورت کروموزوم، لوکیشن، نام اسنیپ و باز موجود در این نقطه است. مثلا شما در rs74648437 در کروموزوم 12 در باز 10553983 در یک نسخه کروموزومی خود دارای الل T و در نسخه دیگر دارای الل C هستید. در یک تست میکرواری حدودا 600 تا 800 نقطه ژنتیکی در یک مرحله قابل خوانش است.
| Allele2 | Allele1 | Pos | Chr | rsID |
| C | T | 10553983 | 12 | rs74648437 |
این تغییرات ممکن است تأثیری بر ظاهر، متابولیسم، یا حتی واکنش ما به داروها داشته باشند. برای مثال، برخی افراد به دلیل وجود یک SNP خاص، به داروهایی مانند آسپیرین بهتر پاسخ میدهند یا در برابر برخی بیماریها مقاومتر هستند. از سوی دیگر، برخی SNPها ممکن است خطر ابتلا به بیماریهایی مانند سرطان یا دیابت را افزایش دهند. بعضی باعث تفاوت در رنگ چشم ما بشوند و برخی تاثیر خاصی نداشته باشند !
روش های مختلف تشخیص SNP ها
روشهای مختلفی برای ارزیابی و شناسایی SNPها (تکنوکلئوتید پلیمورفیسمها) وجود دارد که هر یک بسته به هدف مطالعه، دقت مورد نیاز، تعداد SNPهای مورد بررسی، و بودجه موجود انتخاب میشوند. این روشها شامل تکنیکهای مبتنی بر PCR، توالییابی نسل جدید (NGS)، و میکرواری ژنوتایپینگ است که هر کدام مزایا و محدودیتهای خاص خود را دارند. در ادامه، این روشها به ترتیب بررسی میشوند.
روش های مبنتی بر PCR برای شناسایی SNP ها
اولین گروه روشهای مبتنی بر PCR است که از قدیمیترین و پراستفادهترین تکنیکها برای شناسایی SNPها به شمار میرود. در این روشها، از واکنش زنجیرهای پلیمراز برای تکثیر بخشهای مشخصی از DNA استفاده میشود که حاوی SNPهای مورد نظر هستند. یکی از تکنیکهای رایج در این دسته، تکنیک آرمز PCR یا ARMS-PCR (Amplification Refractory Mutation System) است که از پرایمرهای اختصاصی استفاده میکند تا تنها بخشهایی از DNA که حاوی آلل خاصی هستند تکثیر شوند. روش دیگر، RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) است که از آنزیمهای برشی برای شناسایی SNPها بر اساس ایجاد یا حذف محلهای برش استفاده میکند. همچنین تکنیکهایی مانند TaqMan Assay و High-Resolution Melting (HRM) برای شناسایی SNPها از طریق فلورسانس یا تغییر در الگوهای ذوب DNA کاربرد دارند. اگرچه روشهای مبتنی بر PCR دقت بالایی دارند، اما برای شناسایی تعداد زیادی SNP به دلیل نیاز به واکنشهای جداگانه، بسیار زمانبر و پرهزینه هستند.
در این روش بایستی از قبل SNP مورد نظر شناخته شده و مطالعات انجام شده و در نهایت زمان ارزیابی در نمونه DNA فرد برای SNP خاص جستجو انجام شود. این روش برای اهداف کلینیکی مناسب است اما برای پزشکی فرد محور و روش های ارائه خدمات لایف استایل و DTC روش مناسبی به حساب نمی آید.
روش های مبتنی بر توالی یابی نسل جدید یا NGS
در مرحله بعد، روشهای مبتنی بر توالییابی نسل جدید (NGS) قرار دارند که از پیشرفتهترین فناوریها در این زمینه محسوب میشوند. NGS میتواند کل ژنوم یا بخشهای مشخصی از آن را با دقت بسیار بالا توالییابی کند و در نتیجه SNPهای شناختهشده و ناشناخته را شناسایی کند. یکی از مزیتهای این روش توانایی ارائه اطلاعات جامع در سطح ژنوم است، اما این تکنیک به دلیل هزینههای بالا و نیاز به تحلیلهای پیچیده و زمان بر بودن معمولاً برای پروژههایی با مقیاس محدودتر یا مطالعات عمیقتر استفاده میشود. اگرچه NGS میتواند دادههای زیادی را تولید کند، اما این دادهها نیاز به پردازش و تحلیل تخصصی دارند که ممکن است زمانبر باشد.
میکرواری ژنوتایپینگ یا SNP Array
در نهایت، روش میکرواری ژنوتایپینگ به عنوان یکی از کارآمدترین و پرکاربردترین روشها در شناسایی SNPها معرفی میشود. در این روش، از تراشههای حاوی صدها هزار تا میلیونها پروب اختصاصی استفاده میشود که هر یک برای SNP خاصی طراحی شدهاند. میکرواری به دلیل سرعت بالا، هزینه کم، و توانایی شناسایی تعداد بسیار زیادی SNP در یک بار آزمایش برتری دارد. برخلاف روشهای مبتنی بر PCR که برای هر SNP نیاز به واکنش جداگانه دارند، میکرواری در یک آزمایش امکان تولید حجم عظیمی از دادهها را فراهم میکند که میتوان آنها را برای تحلیلهای بعدی ذخیره کرد. علاوه بر این، دقت بالای میکرواری به دلیل طراحی اختصاصی پروبها برای SNPهای شناختهشده، آن را به ابزاری قابل اعتماد تبدیل کرده است. در مقایسه با روشهای دیگر، هزینه هر SNP در پروژههای بزرگ با استفاده از میکرواری به طور چشمگیری کاهش مییابد و این ویژگی میکرواری را به یک انتخاب ایدهآل برای مطالعات گسترده ژنتیکی تبدیل میکند.
میکرواری ژنوتایپینگ چگونه کار میکند؟
1. طراحی تراشه میکرواری
تراشه میکرواری شامل مجموعهای از پروبهای DNA است که هر کدام برای یک SNP خاص طراحی شدهاند. این پروبها بخش کوچکی از DNA تکرشتهای هستند که به نواحی مشخصی از ژنوم متصل میشوند. هر پروب با دقت بالا برای شناسایی یکی از دو آلل ممکن یک SNP طراحی شده است.
2. جمعآوری و آمادهسازی نمونه DNA
DNA از نمونههایی مانند بزاق یا خون استخراج میشود. سپس، DNA به قطعات کوچکتر تقسیم شده و نشاندار میشود. این نشانگذاری معمولاً با استفاده از مواد فلورسانس انجام میشود تا در مراحل بعدی بتوان DNA هیبرید شده را شناسایی کرد.
3. هیبریداسیون روی تراشه
DNA آمادهشده به تراشه میکرواری اضافه میشود. این تراشه حاوی پروبهای مشخص برای SNPهای هدف است. DNA نمونه به پروبهای مکمل خود متصل (هیبرید) میشود. اگر یک آلل خاص در نمونه وجود داشته باشد، به پروب متناظر متصل خواهد شد.
4. شناسایی سیگنال فلورسانس
پس از هیبریداسیون، تراشه شسته میشود تا DNA غیرمکمل حذف شود. سپس، تراشه با استفاده از یک اسکنر فلورسانس بررسی میشود. این اسکنر سیگنالهای فلورسانس تولید شده توسط DNA هیبرید شده را شناسایی کرده و شدت آنها را اندازهگیری میکند. سیگنالهای فلورسانس نشان میدهند که کدام آلل در نمونه وجود دارد.
5. تحلیل دادهها
اطلاعات فلورسانس به صورت دادههای دیجیتال ذخیره میشوند و توسط نرمافزارهای تحلیل ژنتیکی پردازش میشوند. این نرمافزارها نتایج را برای هر SNP تحلیل کرده و مشخص میکنند که نمونه دارای کدام آللها است.
