تکنیک PCR (Polymerase Chain Reaction) یکی از پایههای اساسی در زیستشناسی مولکولی و تشخیصهای پزشکی است. این روش اجازه میدهد تا قطعات DNA را به طور دقیق و سریع تکثیر کنیم. با این حال، یکی از چالشهای بزرگ در استفاده از PCR، آلودگیهای ناخواسته است که میتواند نتایج را کاملاً تحریف کند. یکی از شایعترین انواع این آلودگیها، “carryover contamination” یا آلودگی carryover است. در این مقاله، به بررسی اینکه carryover چیست، چگونه رخ میدهد، عواقب آن و مهمتر از همه، روشهای مبارزه با آن میپردازیم. این اطلاعات بر اساس اصول علمی استاندارد و تحقیقات اخیر گردآوری شده است.
Carryover چیست؟
Carryover contamination به معنای آلودگی ناشی از انتقال محصولات PCR از واکنشهای قبلی به واکنشهای جدید است. به عبارت سادهتر، وقتی محصولات تکثیری (amplicons) از یک PCR قبلی به طور ناخواسته وارد لوله یا واکنش جدید میشوند، این آلودگی رخ میدهد. این محصولات میتوانند به عنوان الگو (template) در واکنش جدید عمل کنند و منجر به تکثیر اشتباه شوند. این نوع آلودگی معمولاً از طریق قطرات کوچک (aerosols) یا ابزارهای آزمایشگاهی آلوده منتقل میشود.
در PCR، حتی مقدار بسیار کمی از DNA (مانند چند مولکول) میتواند باعث ایجاد سیگنال کاذب شود، به ویژه در آزمایشهای حساس مانند qPCR (PCR کمی). carryover اغلب در آزمایشگاههایی که حجم بالایی از PCR انجام میدهند، شایع است و میتواند نتایج را غیرقابل اعتماد کند.
چگونه Carryover رخ میدهد؟
آلودگی carryover میتواند از طریق چندین مسیر ایجاد شود:
- انتقال هوایی (Aerosols): هنگام باز کردن لولههای PCR پس از واکنش، قطرات کوچک حاوی محصولات PCR میتوانند در هوا پخش شوند و بر روی سطوح یا ابزارها بنشینند.
- ابزارهای آلوده: pipetteها، نکات pipette، لولهها یا سطوح کار که با محصولات قبلی تماس داشتهاند، میتوانند آلودگی را منتقل کنند.
- نمونههای انسانی: دستها یا لباسهای آزمایشگر که با محصولات PCR تماس داشتهاند.
- محیط آزمایشگاه: عدم جداسازی فضاهای پیش-PCR (pre-PCR) و پس-PCR (post-PCR) میتواند این مشکل را تشدید کند.
این آلودگی معمولاً پس از تکمیل واکنش PCR رخ میدهد و به همین دلیل به آن “carryover” میگویند، یعنی “انتقال از قبل”.
عواقب Carryover
عواقب این آلودگی جدی است:
- نتایج کاذب مثبت: در تشخیص بیماریها، مانند عفونتهای ویروسی، میتواند منجر به تشخیص اشتباه شود و درمانهای غیرضروری را تحمیل کند.
- کاهش حساسیت و دقت: در تحقیقات ژنتیکی یا پزشکی قانونی، آلودگی میتواند دادهها را بیارزش کند.
- هزینه و زمان: تکرار آزمایشها برای تأیید نتایج، زمان و منابع را هدر میدهد.
در آزمایشگاههای بالینی، این مشکل میتواند حتی به مسائل قانونی منجر شود.
روشهای مبارزه با Carryover
خوشبختانه، روشهای متعددی برای جلوگیری و مبارزه با carryover وجود دارد. این روشها را میتوان به دو دسته پیشگیرانه و اصلاحی تقسیم کرد:
1. روشهای بیوشیمیایی
- استفاده از UNG/UDG: یکی از محبوبترین روشها، استفاده از آنزیم Uracil-N-Glycosylase (UNG) یا Uracil-DNA Glycosylase (UDG) است. در این روش، از dUTP به جای dTTP در واکنش PCR استفاده میشود. محصولات PCR حاوی اوراسیل میشوند و UNG آنها را تجزیه میکند، در حالی که DNA طبیعی (حاوی تیمین) دستنخورده باقی میماند. این روش بسیار مؤثر است و در واکنشهای جدید اضافه میشود.
- روشهای پس-PCR استرلیزاسیون: مانند روشهای فوتوشیمیایی که محصولات PCR را با استفاده از نور UV یا مواد شیمیایی تجزیه میکنند.
2. روشهای فنی و تجهیزاتی
- PCR بسته (Closed-tube PCR): استفاده از PCR زمان واقعی (real-time PCR) مانند TaqMan یا SYBR Green که نیازی به باز کردن لوله پس از واکنش ندارد و خطر aerosols را کاهش میدهد.
- نکات pipette مقاوم به aerosols: استفاده از filter pipette tips که از ورود aerosols به pipette جلوگیری میکنند.
3. روشهای مدیریتی و آزمایشگاهی
- جداسازی فضاها: ایجاد مناطق جداگانه برای آمادهسازی نمونه (pre-PCR)، تکثیر و تحلیل نتایج (post-PCR). این کار از انتقال فیزیکی آلودگی جلوگیری میکند.
- بهترین شیوههای آزمایشگاهی: استفاده از دستکش، تمیز کردن سطوح با مواد ضدعفونیکننده (مانند bleach یا الکل)، و اجتناب از باز کردن لولههای post-PCR در نزدیکی pre-PCR. همچنین، آموزش پرسنل برای رعایت پروتکلها ضروری است.
- کنترلهای منفی: همیشه شامل کنترلهای منفی در هر batch PCR برای شناسایی آلودگی زودهنگام.
ترکیب این روشها میتواند خطر carryover را به حداقل برساند. برای مثال، در آزمایشگاههای بالینی، ترکیب UNG با PCR بسته بسیار توصیه میشود.
نتیجهگیری
آلودگی carryover یک تهدید جدی برای دقت PCR است، اما با آگاهی و استفاده از روشهای مناسب، میتوان آن را کنترل کرد. از روشهای بیوشیمیایی مانند UNG گرفته تا تغییرات ساده در روتین آزمایشگاهی، ابزارهای زیادی برای مبارزه وجود دارد. در نهایت، رعایت اصول خوب آزمایشگاهی (Good Laboratory Practice) کلیدیترین عامل است. اگر در آزمایشگاه خود با این مشکل روبرو هستید، شروع با ارزیابی پروتکلهای فعلی و افزودن UNG میتواند گام مؤثری باشد. برای اطلاعات بیشتر، به منابع علمی معتبر مراجعه کنید.
