وقتی صحبت از HPLC میشود، عملا با یک تکنیک ساده شامل عبور یک فاز متحرک همراه با نمونه از بین یک فاز ثابت روبرو هستیم. اما وقتی بخواهیم یک ترکیب را با این روش به خوبی تفکیک کنیم با دنیای جدیدی روبرو میشویم.
در توسعه تکنیک HPLC لازم است فازهای ثابت و متحرک به درستی انتخاب شوند و میزان جریان و یا شیب تغییر فاز متحرک بر اساس نیاز تفکیکی ما تعیین شود. یکی از مهمترین بخش های این انتخاب، انتخاب فاز ثابت است.
در ادامه میخواهیم در مورد انواع ستون های HPLC و مشخصات آنها صحبت کنیم. با ما همراه باشید.
دسته بندی کلی ستون های HPLC
ستون‌های کروماتوگرافی مایع (LC) بر اساس نوع HPLC به شش دسته اصلی زیر تقسیم می‌شوند:
- کروماتوگرافی مایع با فاز معکوس (Reverse-Phase LC)
- کروماتوگرافی مایع با فاز عادی (Normal-Phase LC)
- کروماتوگرافی مایع با فاز ترکیبی (Mixed-Mode LC)
- کروماتوگرافی مایع با فاز تبادل یونی (Ion-Exchange LC)
- کروماتوگرافی مایع با فاز حجمی بالا (Size-Exclusion LC)
- کروماتوگرافی مایع با فاز حرارتی (Thermal LC)
البته اگر با زاویه دید دیگری به ستون های کروماتوگرافی نگاه کنیم شاید بتوان ستون های HPLC را به صورت زیر هم دسته بندی کرد:
- ستون‌های با خاصیت فاز معکوس (reversed-phase columns)
- ستون‌های با خاصیت پایداری بالا (high-stability columns)
- ستون‌های با خاصیت سطحی بالا (high-surface area columns)
- ستون‌های با خاصیت آنالیتیکالیتی بالا (high-analytical columns)
- ستون‌های با خاصیت بینایی‌ای بالا (high-resolution columns)
- ستون‌های با خاصیت انتخابی بالا (high-selectivity columns)
- ستون‌های با خاصیت تغذیه‌ای بالا (high-nutrient columns)
- ستون‌های با خاصیت قابلیت بازیابی بالا (high-recovery columns)
- ستون‌های با خاصیت برانگیختگی بالا (high-efficiency columns)
- ستون‌های با خاصیت تخصصی (specialty columns) به منظور جداسازی گروه‌های خاصی از ترکیبات، مانند اسیدهای آمینه، چربی‌ها، و غیره.
ستون های کروماتوگرافی فاز معکوس
ستون‌های کروماتوگرافی مایع (LC) با فاز معکوس (Reverse-Phase LC) می‌توانند بر اساس ماده‌ای که بر روی سطح ستون پوشیده شده، طبقه‌بندی شوند. در این راستا، سه دسته اصلی ستون‌های کروماتوگرافی مایع با فاز معکوس به شرح زیر است:
C18: در این نوع ستون‌ها، سطح ستون با ماده C18 پوشیده شده است. این نوع ستون‌ها برای جداسازی ترکیبات هیدروفوبی و با وزن مولکولی بزرگتر مانند پپتیدها، پروتئین‌ها، آمینواسیدها و نوکلئوتیدها به کار می‌روند.
C8: در این نوع ستون‌ها، سطح ستون با ماده C8 پوشیده شده است. این نوع ستون‌ها برای جداسازی ترکیبات هیدروفوبی و با وزن مولکولی کمتر مانند آنزیم‌ها، کلروفیل، مواد رنگی و عصاره‌های گیاهی به کار می‌روند.
C4: در این نوع ستون‌ها، سطح ستون با ماده C4 پوشیده شده است. این نوع ستون‌ها برای جداسازی ترکیبات هیدروفوبی با وزن مولکولی کمتر از 500 به کار می‌روند.
البته در کروماتوگرافی فاز معکوس ستون‌های RP-HPLC با فازهای دیگری نیز وجود دارند، مانند ستون‌های با فاز C1، C2، C3، C5، C6، C7 و C18-امینو، که هر کدام دارای خواص خاصی در جداسازی ترکیبات هستند. اما معروف ترین ستون های فاز معکوس c4
ستون c18:
ستون HPLC C18 یکی از پر استفاده‌ترین ستون‌های کروماتوگرافی مایع با برخورد فاز معکوس (RP-HPLC) است. C18 به معنای کربن ۱۸ یعنی ستونی است که دارای لایه پوششی کربن با زنجیره‌های طولانی است که به آن یک حساسیت بسیار بالا در جذب ترکیبات هیدروفوبیک (آبگریز) از نمونه دارد. در این ستون، ترکیبات بر اساس ظرفیت حجمی (نسبت ظرفیت جذب به حجم مخصوص ستون)، تفاوت اندازه و شکل مولکولی، قطبیت و دیگر خصوصیات فیزیکی و شیمیایی جدا می‌شوند. به طور کلی، ستون C18 برای جداسازی ترکیبات مانند آمین‌ها، اسیدهای آمینه، پپتیدها، آلکوهول‌ها، کلروفیل، کراتینین، ادویه جات، داروها، انواع مواد شیمیایی و… استفاده میشود. در حالت عمومی، ستون‌های C18 برای کارهای روتین کروماتوگرافی در بسیاری از صنایع شیمیایی، داروسازی، غذایی، آزمایشگاهی و تحقیقاتی استفاده می‌شوند.
ستون های فاز نرمال:
منظور از ستون کروماتوگرافی فاز عادی، ستونی است که در آن فاز پایه پلار است و برای جداسازی ترکیبات با گروه‌های پلار استفاده میشود. برخی از انواع ستون کروماتوگرافی فاز عادی عبارتند از:
۱- ستون سیلیکا ژل: در این نوع ستون، فاز پایه سیلیکا ژل است و از آن به عنوان فاز پایه در کروماتوگرافی مایع با فاز عادی استفاده میشود.
۲- ستون آمینو: در این نوع ستون، فاز پایه حاوی گروه‌های آمینو است و برای جداسازی ترکیبات با گروه‌های کربوکسیلیک و اسیدهای آلی استفاده میشود.
۳- ستون سولفونات: در این نوع ستون، فاز پایه حاوی گروه‌های سولفونات است و برای جداسازی ترکیبات با گروه‌های آمینو استفاده میشود.
۴- ستون سلولز: در این نوع ستون، فاز پایه سلولز است و برای جداسازی ترکیبات با گروه‌های پلار استفاده میشود.
توجه داشته باشید که این لیست، تنها چند نمونه از انواع موجود از ستون کروماتوگرافی فاز عادی است و هنوز انواع دیگری نیز وجود دارد.
تاثیر اندازه ذرات در ستون کروماتوگرافی
اندازه ذرات داخل ستون کروماتوگرافی HPLC تاثیر بسیار زیادی در کارایی جداسازی ترکیبات دارد. ذرات ستون‌های کروماتوگرافی با اندازه کوچکتر عموماً بهبود کارایی جداسازی را ایجاد می‌کنند. این امر به دلیل افزایش سطح مخاطبه و کاهش مسیر رهایش ناپذیر برای ترکیبات در ستون است. بنابراین، با افزایش اندازه ذرات ستون کروماتوگرافی، کارایی جداسازی ترکیبات کاهش می‌یابد.
به طور کلی، ستون‌های کروماتوگرافی HPLC با اندازه ذرات کوچکتر (به عنوان مثال 1.8 میکرون) نسبت به ستون‌های با اندازه ذرات بزرگتر (مانند 5 میکرون)، کارایی بهتری در جداسازی ترکیبات ارائه می‌دهند. اما در عین حال، ستون‌های با اندازه ذرات کوچکتر، به دلیل افزایش فشار سیستم، احتیاج به سیستم‌های پمپاژ و فنی بیشتر دارند. همچنین، با افزایش اندازه ذرات ستون، حساسیت سیستم به ترکیبات نیز کاهش می‌یابد که ممکن است در برخی موارد برای جداسازی ترکیبات خاص مفید باشد.
