بدون شک تا به حال چندین مرتبه سنتز پرایمر داشته اید. مراحل سنتز از نظر یک بیولوژیست تازه کار اینطور است. طراحی، ارسال برای سنتز، دریافت …
همه به صورت پیش فرض کمترین غلظت را سفارش میدهیم و همیشه پیش فرض ما روش تخلیص Salting Out است که بدون هزینه انجام میشود. اما آیا همیشه این سفارش جوابگو است ؟
اگر در حرفه خود به سنتز پرایمر نیاز دارید، پیشنهاد میکنم این مطلب را مطالعه کنید.
ویژگی‌های قابل انتخاب در زمان سفارش سنتز پرایمر
درزمان سنتز پرایمر شما میتوانید تغییرات یا Modification های ابتدا، انتها و میانه پرایمر خودتان را انتخاب کنید. در کنار این میتوانید روش تخلیص پرایمر بعد از تولید را نیز انتخاب کنید. اکثر تولید کنندگان پرایمرهای خودشان را به روش هایی مثل Mass Spectrometry کنترل کیفی میکنند اما میتوانید برای افزایش اطمینان با پرداخت هزینه بیشتر از روش های دیگر کنترل کیفی مثل Tandem Mass Spectrometry نیز استفاده کنید.
اگر پژوهشگری هستید که برای پرایمر خودتان Modification سفارش داده اید، پس حتما پروژه پیشرفته ای در حال انجام دارید و حداقل از تغییر مورد نظر خودتان اطلاعات کاملی دارید. اگرچه در مورد این تغییرات در بخش سنتز پرایمر صحبت خواهد شد، اما بیشتر تمرکز ما در مورد روش های تخلیص و دلیل انتخاب این روش ها است.
روش های تخلیص گزینه بعدی قابل انتخاب شما هستند. روش های تخلیص باعث میشوند پرایمری با خلوص بیشتر در اختیار شما باشد. شما میتوانید روش هایی مانند HPLC یا OPC یا PAGE را برای تخلیص پرایمر خود استفاده کنید.
مراحل سنتز پرایمر به روش شیمیایی
پیش از اینکه در مورد ویژگی های سنتز پرایمر صحبت کنیم، بهتر است مروری بر فرایند سنتز پرایمر داشته باشیم. بعد از شناسایی فرایند سنتز میتوانیم با دید روشن تری به فرایندهای تخلیص و سایر موارد داشته باشیم.
الیگونوکلئوتیدهای کوتاه که پرکاربردترین آنها همان پرایمرها هستند با روش شیمیایی و در 4 مرحله تکرار شونده سنتز میشوند. این روش که امروزه توسط کامپیوتر کنترل میشود با مرحله اتصال نوکلئوتید اول به یک بستر جامد که معمولا بیدهای شیشه ای یا پلی استیرن هستند آغاز شده و در ادامه نوکلئوتیدها یک به یک به باز اولیه متصل میشوند. مراحل سنتز پرایمر به صورت زیر است:
1- Deblocking : آغاز کننده سنتز پرایمر، نوکلئوتیدی است که به یک بستر ثابت متصل شده. با توجه به پرایمر شما و اینکه در بخش ´3 پرایمر شما چه بازی قرار دارد این نوکلئوتید به محیط اضافه میشود. برای اینکه این باز در طی مراحل آماده سازی واکنش ناخواسته ای نداشته باشد، OH موجود در بخش ´5 آن با یک گروه ترتیل محافظت شده است. این گروه که دی متیل ترتیل یا DMT است به عنوان یک بلاکر از هر واکنشی در بخش OH واکنش جلوگیری میکند، پس برای شروع واکنش سنتز پرایمر ابتدا باید این بلاکر حذف شود. جداسازی دی متیل ترتیل با استفاده از ترکیب TCA (trichloroacetic acid) انجام میشود.
2- Coupling : وقتی که عامل مهار کننده یا بلاکر حذف شده است، سمت ´5 اولیگوی ما آماده واکنش با باز جدید است. باز جدید به صورت phosphoramidite monomer به محیط واکنش اضافه میشود. مونومر فسفرامیدیت بسیار واکنش پذیر است و تمایل زیادی به اتصال به OH آزاد باز قبلی روی رشته اولگوی ما دارد. به محض اضافه شدن مونومرها، این مونومرها با واسته یک فسفات به باز قبلی متصل میشوند.
3- Oxidation : فسفید تری استر ایجاد شده در مرحله قبلی بسیار ناپایدار است و بایستی به یک حالت پایدار تبدیل شود. مرحله اکسیداسیون برای تبدیل پیوند دو نوکلئوتید انجام میشود. معمولا برای این مرحله از ترکیب ید، پیریدین و آب استفاده میشود.
4- Capping : بدون شک تمامی بازهای موجود در محیط نمیتوانند وارد واکنش شوند و بعضی از این بازها در محیط واکنش باقی میمانند. بازهای باقی مانده میتوانند در مراحل بعدی اختلال ایجاد کنند و با یکدیگر و یا با انتهای اولگو واکنش دهند. در مرحله کپینگ، تمامی بازهایی که در محیط باقی مانده اند غیر فعال شده تا در ادامه واکنش اختلالی ایجاد نکنند. محصول این مرحله اولیگو ای است که به بستر ثابت متصل است و ضایعات این مرحله گروه های غیر فعال شده محلولی است که میتوانند از سیستم خارج شوند.
در ادامه مرحله Deblocking تکرار شده تا اولیگو آماده پذیزش باز جدید شود.برای اضافه شدن هر باز یک بار این سیکل تکرار خواهد شد.
مرحله آخر: Cleavage
بعد از اتمام سنتز پرایمر، حال نوبت جداسازی قطعه پرایمر سنتز شده از بستر جامد است. در این مرحله پیوند استری انتهای ‘3 توسط محلول آمونیاک برداشته شده و محصول این مرحله پرایمر ما با هر دو انتهای آزاد در حالت محلول بوده که از بستر جامد جدا شده است.
چرا بعد از سنتز پرایمر باید از روش تخلیص استفاده شود ؟
سنتز پرایمرهای DNA با استفاده از روش های شیمیایی مختلف انجام می شود. این روش ها معمولاً شامل مواد شیمیایی است که برای تولید پرایمر، از جمله دی‌نوکلئوتیدها (dNTPs)، بنزیل کلراید، تترا آزید استندهیدرات (TAS) و ایدئالیک اسید هستند. اما با این حال، ممکن است برخی از این مواد شیمیایی همراه با پرایمر به صورت آلاینده در محصول نهایی باقی بمانند که ممکن است توسط آنزیم‌های تعیین شده برای انجام واکنش های DNA مختلف، مثل PCR، تأثیر منفی داشته باشند.
بنابراین، برای از بین بردن آلاینده های موجود در پرایمرهای تولید شده با روش های شیمیایی، از روش های تخلیص استفاده می شود. این روش ها شامل تکنیک های مختلفی مانند الکتروفورز ژل، کروماتوگرافی، ستون تخلیص، فیلتراسیون، استخراج و کریستالیزاسیون هستند. با استفاده از این روش ها، آلاینده های موجود در پرایمرهای DNA تصفیه شده و پرایمرهایی که برای تکثیر DNA و استفاده در روش های مختلف مورد استفاده قرار می گیرند، از سایر ترکیبات جدا می شوند. به عبارت دیگر، تخلیص پرایمرها باعث می شود که پرایمرهای خالص تر و با کیفیت به دست آید که این موضوع بهبود کیفیت نهایی تولیدات DNA و عملکرد آزمایشات مختلفی که از آنها استفاده می شود، کمک می کند.
یکی از موارد دیگری که ما را نیازمند روش های تخلیص میکند، پرایمرهای ناتمام هستند. این پرایمرها در حالت کلی مشکلی ایجاد نمی کنند اما در برخی از فرایندهای زیستی مختل کننده هستند. به عبارت دیگر
در مخلوط پرایمری که شما دریافت میکنید، تمام پرایمرها کامل نیستند. به عبارت دیگر تمامی پرایمرها توالی مورد نظر ما را ندارند. علت این رویداد، صد درصد نبودن بازدهی فرایند Coupling است.
منظور از Coupling Efficiency چیست ؟
در سنتز پرایمر هر نوکلئوتید به انتهای آزاد نوکلئوتید آخری که به زنجیره در حال رشد متصل است، متصل میشود. اگر بازده این سنتز 100 درصد باشد، تمامی انتها های آزاد فعال که منتظر دریافت نوکلئوتید هستند با نوکلئوتید جدید امتداد پیدا میکنند. اما به ندرت واکنش شیمیایی ای مشاهده میشود که بازده 100 درصد داشته باشد.
بازده استاندارد Coupling efficiency در سنتز پرایمر در مقیاس صنعتی، چیزی در حدود 98.5 درصد است و ماکسیمم Coupling efficiency قابل دست یابی در سنتز پرایمر 99 درصد است. این به این معنی است که در هر چرخه یا اضافه شدن هر نوکلئوتید، 1 درصد از میزان محصول نهایی ما کاسته خواهد شد.
Coupling efficiency به کیفیت مواد اولیه ( آمیدیت ها و محلول ها ) ، دستگاه سنتز پرایمر و پروتوکل های مورد استفاده برای سنتز پرایمر وابسته است.
به همین علت یکی از اولویت‌های شرکت های تولید کننده دست یابی به بالاترین Coupling efficiency را در سنتز پرایمر است به عنوان مثال شرکت متابیون آلمان یکی از شرکتهایی است که ادعا دارد در صنعت پرایمر توانسته، از ماکسیمم میزان Coupling efficiency قابل دست یابی نیز بالاتر رفته و به Coupling efficiency برابر 99,7% دست پیدا کند.
پرایمرهای ناتمام
اگر قرار است توالی ATCGTATCGTCTCG سنتز شود . اولین نوکلئوتید متصل به بستر نوکلئوتید A است. در مرحله دوم آمیدیت T به محیط وارد میشود. فعال سازی انجام شده و 98 درصد از پرایمرها به صورت AT خواهند بود. اما 2 درصد همچنان A هستند. در مرحله غیر فعال شدن انتهای A های واکنش نداده بلاک میشود. در مرحله بعد این A ها دیگر پذیرای نوکلئوتید جدید نخواهند بود و به همین دلیل به صورت کوتاه و ناتمام باقی می مانند. در مرحله دوم نیز 2 درصد از پرایمرها به صورت AT خاتمه پیدا میکنند. همینطور مراحل بعد. به عبارتی برای یک پرایمر در فرایند سنتز پرایمر با بازدهی 98 درصد، هر مرحله 2 درصد از پرایمرها ناتمام باقی میمانند. به همین دلیل است که روش سنتز شیمیایی دارای محدودیت طول پرایمر است. به همین دلیل نیز در مخلوط نهایی پرایمر ایجاد شده تعداد زیادی پرایمر با طول های ناتمام وجود دارند و ممکن است در برخی از موارد استفاده از پرایمر اختلال ایجاد کنند.
انواع روش های تخلیص پرایمر به صورت خلاصه
در جدول زیر انواع روش‌های مختلف تخلیص پرایمر و شرایط آن معرفی شده است.
| روش تخلیص | توضیح | مزایا |
|---|---|---|
| Desalt | در این روش اولیگوها از یک ستون کروماتوگرافی عبور میکنند و نمک های موجود در ترکیب از آن حذف میشود اما اولیگوهای کوتاه و معیوب حذف نمیشوند. | حاصل این روش یک ترکیب DNA بدون نمک است که برای انواع PCR و Sequencing قابل استفاده است. کم هزینه بوده و میزان اتلاف کمی دارد. |
| OPC (Cartridge) | با استفاده از کروماتوگرافی فاز معکوس انجام میشود و میتواند علاوه بر نمک ها، پرایمرهای ناقص را نیز از نمونه جداسازی کند. | در مواردی که نیاز به پرایمر کاملا خالص باشد این روش پیشنهاد میشود. میزان اتلاف پرایمر در این روش بیشتر از روش Desalt است. این روش تخلیص برای اولیگوهای بین 7 تا 55 نوکلئوتید قابل انجام است. |
| HPLC | مشابه روش کارتریج با استفاده از کروماتوگرافی فاز معکوس انجام شده و میتواند توالی های ناقص را از پرایمرهای کامل جداسازی کند. | بیشترین درصد پرایمر کامل در این روش تضمین میشود. در خروجی حاصل از این روش نزدیک به 85 درصد پرایمرها کامل هستند. اما بیشترین میزان اتلاف پرایمر مربوط به این روش است. در این روش اولیگوهای بین 10 تا 55 نوکلئوتید قابل تخلیص هستند. |
| PAGE | جداسازی با استفاده از روش الکتروفورز انجام شده و خلوصی بالاتر از 85 درصد قابل دستیابی است. | محصول این روش خلوص بسیار بالایی دارد. اولیگوهای از 7 تا 100 نوکلئوتید قابل تخلیص با این روش هستند. |
پرایمر تخلیص شده به روش Desalting به خوبی برای یک PCR، واکنش توالی یابی، AFLP و یا پرینت کردن یک چیپ میکرواری مناسب است. اما برای مواردی مانند مطالعات antisense ، Gel shift assays و Site-directed mutagenesis پیشنهاد میشود از روش های تخلیصی که قطعات ناقص را حذف میکنند استفاده کنید.
برای پرایمرهایی که در انتهای ‘5 خود دارای توالی خاصی مانند یک جایگاه برش، محل اتصال پلیمراز یا یک نشانه هستند، مانند پرایمرهای کلونینگ پیشنهاد میشود برای افزایش کارایی، از روش های تخلیصی که پرایمرهای ناقص را جداسازی میکنند استفاده کنید.
منظور از Synthesis Scale چیست ؟
وقتی سنتز پرایمر انجام میشود، این سنتز بر اساس ظرفیت مشخصی از بستر جامد انجام خواهد شد. به عبارتی شما بر اساس میزان پرایمر مورد نیاز خود بستر ثابت که باز اول به آن متصل شده در محیط واکنش قرار میدهید. اگر 40 nmole پرایمر نیاز داشته باشید، 40 nmoles از باز اول به محیط واکنش خود اضافه میکنید. برای یک پرایمر با طول 25 نوکلئوتید، بیشترین میزان پرایمر نا موفق ( پرایمری که به هر علتی به صورت کامل سنتز نشده باشد و یا در مراحل بعد از سنتز هدر رود ) در حدود 25 درصد خواهد بود. به همین علت سنتز 40 نانومول پرایمر منجر به تولید 40 نانو مول پرایمر نهایی نمیشود.
حذف پرایمرها ممکن است در مرحله سنتز، پروسس بعد از سنتز، انتقال مواد و یا کنترل کیفی باشد.
به همین علت میزان محصول نهایی به صورت رنجی از OD260 ارائه میشود. به عنوان مثال، همانطور که در فرم ثبت سفارش پرایمر مشخص شده، در صورت سفارش پرایمر با غلظت 2 نانومول، میزان OD260 قابل تحویل به شما از 3 تا 5 خواهد بود. به عبارتی شرکت ما ارائه OD بالاتر از 3 را برای شما تضمین خواهد نمود.
در جدول زیر حداقل میزان OD تضمین شده برای اولیگوهای بدون مودیفیکیشن در غلظت های مختلف سفارش ارائه شده است.
| Synthesis Scale | Desulted | OPC | HPLC |
|---|---|---|---|
| 0.02 µmol | 3 | 1 | 1 |
| 0,04 µmol | 5 | 3 | 2.5 |
| 0,2 µmol | 16 | 15 | 8 |
| 1 µmol | 80 | – | 35 |
آیا میتوانیم دو قطعه اولیگو سنتز شده مکمل را به صورت مستقیم برای Ligation استفاده کنیم ؟
اگر قصد کلون سازی یک قطعه کوتاه یا ایجاد یک Multiple Cloning Site در میانه یک وکتور داشته باشیم ممکن است آزمایشی طراحی کنیم که در آن دو پرایمر یا اولیگو نسبتا کوتاه که مکمل یکدیگر هستند، به صورت استیکی و یا بلانت مستقیما به عنوان یک قطعه در وکتور کلون شوند.
اگر نوع اتصال از نوع استیکی بوده و انتهاهای برش خورده وکتور شما، دارای فسفات باشند، این آزمایش قابل انجام است، اما دقت داشته باشید که اولیگو سنتز شده دارای فسفات ‘5 نیست و اگر بعد از برش خود، وکتور را با فسفاتاز تیمار کرده باشید، کلونینگ قابل انجام نیست.
اگر اتصال شما از نوع بلانت است، اگرچه ممکن است لیگیشن قابل انجام باشد اما احتمال وقوع بسیار کاهش پیدا خواهد کرد. به همین دلیل اگر در طراحی آزمایش خود نیازمند اولیگو ای هستید که دارای فسفات ‘5 باشد، بایستی قبل از انجام آزمایش اولیگو را با آنزیم کیناز تیمار کنید.
همچنین اگر محصول PCR شما بدون برش خوردن در وکتور کلون می شوند، به علت اینکه بخش ‘5 محصول PCR، در واقع بخش ‘5 اولیگو است، لذا محصول PCR شما دارای فسفات ‘5 نیست.
یکی از آنزیم‌های متداول برای فسفریله کردن انتهای اولیگو و یا محصول PCR آنزیم T4 Polynucleotide Kinase است.
حداکثر طول ممکن برای سنتز پرایمر چقدر است ؟
در واقع معیار اصلی در محدودیت اندازه پرایمر، محدودیت در روش تخلیص توالی و بازده کوپلینگ یا coupling efficiency دستگاه سنتز پرایمر است. با شرایط ذکر شده، بالاترین اندازه پرایمری که شرکت اینترون سنتز میکند 220 نوکلئوتید است.
با این وجود سنتز با قیمت استاندارد تنها تا 80 نوکلئوتید انجام شده و بالاتر از این طول نیازمند هزینه بیشتر برای سنتز پرایمر است.
علت این امر این است که در پرایمرهای بالاتر از 80 نوکلئوتید برای بالا رفتن Coupling Efficiency میزان بیشتر از مواد اولیه و آمیدیت ها به دستگاه وارد میشود به همین دلیل هزینه پرایمر بالاتر از 80 نوکلئوتید بالاتر از پرایمرهای کوتاه تر است.
