High-Resolution Melting (HRM) یک تکنیک قدرتمند و اقتصادی برای شناسایی تفاوت‌های ژنتیکی مانند SNPها است. این روش از تغییرات در دمای ذوب (Tm) DNA استفاده می‌کند تا تفاوت‌های کوچک در توالی DNA را شناسایی کند. HRM به دلیل حساسیت بالا و نیاز نداشتن به پروب‌های فلورسانسی اختصاصی، به یک ابزار رایج برای شناسایی SNPها تبدیل شده است.
اصول شناسایی SNPها با HRM
ابتدا بخشی از DNA که SNP هدف در آن قرار دارد، با استفاده از PCR تکثیر می‌شود. در این مرحله از رنگ‌های فلورسانسی خاص (مانند EvaGreen یا SYTO9) استفاده می‌شود که به DNA دو‌رشته‌ای متصل می‌شوند. پس از پایان PCR، دمای نمونه به تدریج افزایش داده می‌شود. با افزایش دما، رشته‌های DNA از یکدیگر جدا می‌شوند (دناتوراسیون) و رنگ فلورسانسی از DNA جدا می‌شود، در نتیجه سیگنال فلورسانس کاهش می‌یابد. تغییرات فلورسانس بر اساس دما ثبت می‌شود و یک منحنی ذوب (Melting Curve) ایجاد می‌گردد.
تأثیر SNP بر دمای ذوب
وجود SNP در توالی DNA می‌تواند دمای ذوب را تغییر دهد. این تغییر معمولاً به دلیل تفاوت در محتوای GC یا پایداری جفت‌بازها در منطقه جهش رخ می‌دهد. DNAهای حاوی آلل‌های مختلف (مانند AA، AG، یا GG) منحنی‌های ذوب متفاوتی تولید می‌کنند. این تفاوت به راحتی توسط دستگاه HRM قابل تشخیص است.
ویژگی‌های شناسایی SNPها با HRM
HRM می‌تواند بین هموزیگوت‌ها (مثلاً AA یا GG) و هتروزیگوت‌ها (مثلاً AG) تمایز قائل شود. DNA هتروزیگوت معمولاً منحنی ذوبی با شیب کمتر یا دو قله ایجاد می‌کند. این روش حتی تغییرات تک‌نوکلئوتیدی کوچک را شناسایی می‌کند، زیرا این تغییرات می‌توانند به طور قابل توجهی دمای ذوب DNA را تحت تأثیر قرار دهند. برخلاف روش‌هایی مانند TaqMan Assay، HRM نیازی به طراحی و استفاده از پروب‌های فلورسانسی ندارد. این امر هزینه‌ها را کاهش داده و فرایند را ساده‌تر می‌کند.
مزایای استفاده از HRM برای شناسایی SNPها
به دلیل استفاده از رنگ‌های عمومی و عدم نیاز به پروب، هزینه این روش نسبت به روش‌های دیگر کمتر است. شناسایی SNPها در همان دستگاه Real-Time PCR و بلافاصله پس از پایان PCR انجام می‌شود. علاوه بر SNPهای شناخته‌شده، می‌تواند SNPهای ناشناخته را نیز بر اساس تفاوت‌های منحنی ذوب تشخیص دهد. منحنی‌های ذوب تولیدشده، تفاوت‌های جزئی بین آلل‌ها را به وضوح نشان می‌دهند.
کاربردهای HRM در شناسایی SNPها
HRM به طور گسترده در مطالعات ارتباط ژنومی (GWAS) برای بررسی تأثیر SNPها در صفات مختلف یا بیماری‌ها استفاده می‌شود. در فارماکوژنتیک، SNPهایی که پاسخ به داروها را تحت تأثیر قرار می‌دهند، با استفاده از HRM شناسایی می‌شوند. SNPهایی که با بیماری‌های خاص مانند سرطان، دیابت، یا بیماری‌های قلبی مرتبط هستند، با HRM به سرعت و با دقت شناسایی می‌شوند. همچنین برای شناسایی واریانت‌های ژنتیکی در جمعیت‌های مختلف یا بررسی تنوع ژنتیکی در موجودات زنده استفاده می‌شود.
نتیجه‌گیری
HRM یک روش ساده، سریع و دقیق برای شناسایی SNPها است. این روش نه تنها هزینه کمتری دارد، بلکه توانایی شناسایی تغییرات کوچک ژنتیکی را نیز دارد، که آن را به یک ابزار ارزشمند در تحقیقات ژنتیکی و تشخیص‌های پزشکی تبدیل کرده است.
