اصول و مبانی تکنیک PCR-RFLP

رایج ترین تغییرات ژنتیکی در ژنوم که می‌توانند بروز بیماریها را تحت تاثیر قرار دهند چند شکلی‌های تک نوکلئوتیدی  در سطح ژنوم هستند. چندشکلی‌ها به طور طبیعی در DNA ژنومی انسان وجود دارند و در شناسایی تفاوت‌های فردی در ارتباط با استعداد ابتلا به بیماری‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرند. روش های متعددی برای شناسایی اسنیپ ها وجود دارد که شامل توالی یابی، Tetra arms PCR، PCR-RFLP و HRM-Real time PCR و PCR-SSCP می باشند. در میان روش های مذکور روش PCR-RFLP پر استفاده ترین روش کاربردی در شناسایی اسنیپ ها محسوب می گردد. در این جا ما به توضیح  تکنیک PCR-RFLP و نکات کلیدی آن می پردازیم.

مقدمه

SNP مخفف پلی مورفیسم تک نوکلئوتیدی می‌باشد. SNP‌ها تغییراتی هستند که در یک نوکلئوتید خاص در DNA رخ می‌دهند که در نتیجه آن، یک نوکلئوتید با نوکلئوتید دیگری جایگزین می‌شود. این جابه جایی می تواند منجر به تغییر اسید امینه و تغییر ساختار پروتئین گردد ازین رو اسنیپ ها رو به دو دسته اسنیپ های هم معنی و غیر هم معنی طبقه بندی می کنند. SNP‌ها از جمله‌ از تغییرات رایج با فراوانی یک درصد در DNA می‌باشند که بر روی ویژگی‌های مختلف فردی و بیماری‌ها تأثیرگذار هستند. SNPها از اهمیت بسزایی در بخش‌های تحقیقاتی مانند انسانی، بیوانفورماتیکس و پزشکی شخصی سازی‌شده برخوردار‌ند. بررسی SNP‌ها در رابطه با بیماری‌ها از اهمیت بسزایی برخوردار است. به طور مثال، برخی از SNP‌ها ممکن است با بروز بیماری‌های ژنتیکی مرتبط باشند. با بررسی SNP‌ها، می‌توان ویژگی‌ها و اختلالات ژنتیکی مرتبط با بیماری‌ها را بررسی کرد. این امر می‌تواند در تشخیص، پیش‌بینی و درمان بیماری‌ها در حوزه پزشکی شخصی‌سازی شده به کار گرفته شود.

تکنیک های مطالعه اسنیپ ها

مطالعه و تعیین وضعیت اسنیپ ها با استفاده از تکنیک های مختلف مولکولی مانند PCR-RFLP، Tetra ARMs-PCR، توالی یابی، PCR-SSCP، HRM-real time PCR و Real time PCR-Probe در آزمایشگاه صورت می گیرد. هریک از روش های مذکور دارای مزایا و محدودیت های خاص خود می باشند. در میان روش های مذکور روش PCR-RFLP کاربردی ترین روش می باشد. از محاسن این تکنیک می توان به دقت تشخیصی بالا آن اشاره نمود و از محدودیت های آن می توان به قیمت بالای آنزیم های برشی و محدودیت در دسترس بودنشان اشاره کرد.

تکنیک PCR-RFLP

این تکنیک از دو قسمت PCR و RFLP تشکیل شده است. در این تکنیک ابتدا قطعات DNA محتوی اسنیپ های مورد مطالعه توسط واکنش زنجیره ای پلی مراز یا PCR تکثیر شده و سپس قطعات مورد نظر تکثیری توسط عمل هضم آنزیم قرار می گیرند قطعات حاصل از عمل هضم آنزیم بر روی الکتروفوز ران شده و با توجه به باندهای حاصل وضعیت ژنوتیپ هر فرد برای یک اسنیپ خاص مشخص میگردد.

مراحل تکنیک PCR-RFLP به منظور مطالعه اسنیپ ها

مراحل تکنیک PCR-RFLP شامل استخراج DNA از نمونه های مورد مطالعه (نمونه بزاق، خون و بافت)، طراحی پرایمر برای اسنیپ مورد نظر، انجام PCR و تکثیر قطعه DNA محتوی اسنیپ مورد نظر و تیمار با آنزیم های برشی مختص همان اسنیپ و در نهایت لود کردن نمونه ها  بر روی ژل الکتروفورز و مشاهده ژنوتیپ ها توسط ژل داک می باشد.

استخراج DNA از نمونه ها

استخراج DNA از نمونه های بزاق، خون و یا بافت می تواند با استفاده از روش نمکی و یا کیت های مخصوص هر نمونه صورت گیرد که روش استخراج مطابق دستور العمل خاص هر روش صورت می گیرد. در این مرحله نمونه ها DNA پس از استخراج توسط روش های کیفی و کمی مورد بررسی قرار میگیرند. موفقیت‌ در تحقیقات مولکولی در درجه اول‌ وابسته‌ به‌ کیفیت DNA استخراج‌ شده‌ است. پس بایستی بعد از استخراج‌ و قبل‌ از انجام‌ هر گونه ‌آزمایشی ‌کیفیت‌ و کمیت DNA استخراج‌ شده‌ و مقدار خلوص‌ آن اندازه‌گیری شود. به منظور تعیین کیفیت و کمیت DNA استخراج ‌شده از دو روش استفاده می گردد. الف: تعیین کمیت  DNA: با این روش می­توان غلظتDNA  را با استفاده از جذب نوری در طول موج 260nm و رابطه زیر به دست آورد:

ضریب رقت × 50 × جذب در nm 260 = غلظت DNA در محلول بر حسب g/mlμ

OD₂₆₀ 1 معادل با g/mlμ 50،DNA دو رشته­ای است.

ب: تعیین کیفیت DNA : با استفاده از این روش کیفیت DNA را نیز می‌توان تعیین کرد، یعنی میزان ناخالصی ناشی از پروتئین را هم با استفاده از جذب نوری آن در طول موج 280 نانومتر اندازه­گیری کرد و سپس میزان خالص بودن DNA را می­توان از نسبت دو جذب به دست آورد. برای تعیین کیفیت DNA استخراج شده می توان نمونه ها را بر روی ژل الکتروفورز 1 درصد لود کرد و با مشاهده باند DNA استخراج شده کیفیت DNA استخراج شده رو بررسی نمود.  

طراحی پرایمر و انجام PCR  

برای مطالعه اسنیپ مورد نظر بایستی آن قسمت DNA محتوی اسنیپ تکثیر گردد به منظور تکثیر اسنیپ بایستی پرایمرهای اختصاصی برای آن اسنیپ مورد نظر طراحی گردد طراحی پرایمر می تواند به روش دستی یا به استفاده از نرم افزارهای بیوانفورماتیکی صورت گیرد. پس از طراحی پرایمر برای اسنیپ مورد نظر واکنش PCR انجام می گردد. فرآیند تکثیر  DNAمحتوی اسنیپ مورد مطالعه به صورت تصاعد هندسی بوده و بنابراین مقادیر زیادی از مولکول DNA هدف محتوی اسنیپ مورد مطالعه به دست می­آید.

تکثیر قطعه مورد نظر به روش PCR طی سه مرحله انجام می­پذیرد :

1) جداشدن دو رشته DNA الگو از یکدیگر: پیوند­های هیدروژنی اتصال دهنده دو رشته DNA در دمای 94 درجه سانتی­گراد شکسته می­شوند. بنابراین در این حرارت دو رشته DNA الگو از هم جدا شده و پس از تک ‌رشته­­ای شدن DNA الگو، سایر اجزا شرکت‌کننده در واکنش، به غیر از آغازگرها فعالیت خود را آغاز می­کنند.

2) اتصال آغازگرها : در این مرحله آغازگر­ها به رشته  DNAالگو (که دو رشته آن از هم جدا شده‌اند) می­چسبند. دمای اتصال بسته به دمای ذوب آغازگر­ها و درصد GC  هر آغازگر تنظیم می­شود که معمولا بین 50 تا 65 درجه سانتی­گراد می­باشد.

3) گسترش پرایمرها : مناسب‌ترین دما برای گسترش آغازگرها دمای 72 درجه می‌باشد.

 

پس از انجام فرایند  PCRجهت اطمینان از درستی انجام واکنش، محصولات PCR بر روی  ژل آگارز 1 درصد ران شده و سپس درون دستگاه ژل داک قرار گرفته تا فرایند تکثیر و کیفیت آن مورد بررسی قرار گیرد. به گونه‌ای که پس از بررسی صحت قطعه تکثیری و وضوح آن، نمونه‌های مناسب جهت انجام عمل هضم آنزیمی و تعیین ژنوتیپ انتخاب می شوند.

هضم آنزیمی

در روش PCR- RFLP پس از انجام عمل  PCRو تکثیر توالی مورد نظر بایستی قطعه تکثیر یافته در معرض آنزیم‌های محدودالاثر اختصاصی مناسب قرار گیرد تا تعیین آلل­ها انجام شود. محصول PCR در معرض آنزیم برشی مربوطه (به همراه بافر آنزیمی و آب مقطر) قرار میگیرد. در PCR-RFLP  ابتدا اسنیپ مورد بررسی توسط آغازگر­هایی که برای آلل­های وحشی و موتانت مشترک است تکثیر و سپس محصولات  PCR، تحت عمل هضم آنزیمی قرار می­گیرند. در این صورت آنزیم توالی جهش یافته را بریده ولی قادر به بریدن توالی سالم نمی­باشد و یک قطعه واحد از آن باقی می_­گذارد و یا بالعکس. از محدودیت‌های این روش می‌توان به زمان بر بودن مرحله هضم اشاره کرد به علاوه تنها پلی مورفیسم‌های تک نوکلئوتیدی‌ای را می‌توان شناسایی کرد که در محدوده توالی برشی آنزیم محدودگر قرار داشته باشند.آنزیم­های محدودگر، اندونوکلئازهایی‌اند که می‌توانند یک توالی ویژه‌ای از DNA دو رشته‌ای را شناسایی کرده و سپس برش بزنند این آنزیم‌ها بسته به نوع برشی که ایجاد می‌کنند، می‌تواند سبب ایجاد انتهای چسبنده و یا کور شوند. طبق دستورالعمل آنزیم‌های محدودگر، یک واحد آنزیم مقدار آنزیمی است که یک میکروگرم DNA را در بافر و دمای مناسب در مدت یک ساعت برش دهد. عمل هضم آنزیمی DNA بسته به دامنه فعالیت آنزیم، در دمای مناسب و زمان مشخص انجام می‌شود و به دنبال آن محصول هضم شده بر روی ژل آگارز3% توسط الکتروفورز بررسی می­شود. پس از انجام الکتروفورز نمونه ها توسط ژل داک تصویر برداری شده و ژنوتیپ هر نمونه مشخص می گردد. با توجه به تعداد باندهای حاصل می توان ژنوتیپ هر فرد را تعیین کرد. در شکل زیر اسنیپ   T>Gدر جایگاه برشی GAATTC قرار گرفته است در صورت وجود آلل T برش توسط آنزیم محدودگر صورت می گیرد و در صورت وجود آلل G جایگاه برش برای ایجاد برش وجود نداشته و آنزیم محدودگر قادر ایجاد برش نمی باشد. با توجه به مطالب مذکور می توان گفت در افراد با  ژنوتیپ TT  چون برش انجام میشود محصول PCR به دو قطعه تبدیل شده و ما دو باند مختلف خواهیم داشت در افراد با ژنوتیپ GG هیچگونه برشی صورت نمی گیرد و محصول PCR بدون برش باقی مانده و ما تنها یک باند خواهیم داشت. در افراد هتروزیگوت TG نیمی از محصول دچار برش می شوند و نیم دیگر برش نخورده باقی خواهند ماند بنابراین ما سه باند مختلف مشاهده خواهیم کرد. جایگاه برشی برخی از آنزیم دارای تقارن خاصی می باشد که به توالی پالیندرومیک گفته می شود. برخی از آنزیم های محدودگر پس از ایجاد برش انتهای تک رشته ای ایجاد می کنند که به آن انتهای چسبنده میگویند و برخی فاقد انتهای چسبنده هستند که به آن انتهای کور گفته می شوند. انزیم های محدود گر را بر اساس توالی های برشی پالیندرومیک و ایجاد انتهای کور و یا چسبنده به انواع مختلف طبقه بندی میکنند.

اساس تکنیک PCR- RFLP برای مطالعه یک اسنیپ قرار گرفتن آن اسنیپ در جایگاه برش (هضم) آنزیم محدودگر مختص آن جایگاه برشی است. به عبارت دیگر ما بایستی جایگاه برشی جوری تنظیم کنیم که محدوده اسنیپ ما را در بر گیرد.

نکات کلیدی در تکنیک PCR-RFLP

1) استخراج DNA اگر به درستی صورت نگیرد ادامه مراحل کار به مشکل بر می خورد بنابراین بایستی DNA استخراج شده از نظر خلوص و غلظت مورد تایید باشد.

2) طراحی پرایمر بایستی به گونه ای صورت گیرد که جایگاه برشی محتوی اسنیپ مورد نظر در مناطق نزدیک به پرایمرهای فوروارد و ریورس نباشد چرا که در غیر این صورت ما شاهد باندهای کوچک تر از 50 جفت باز خواهیم بود که شاسایی آن ها با ژل الکتروفورز سخت تر و حتی امکان پذیر نمی باشد. علاوه بر آن طراحی پرایمر بایستی به گونه ای صورت گیرد که جایگاه های برش غیر اختصاصی در محصول PCR وجود نداشته باشد. به ازای وجود یک جایگاه برش غیر اختصاصی ما دو قطعه و باند غیر اختصاصی خواهیم داشت که هیچ نقشی در تعیین ژنوتیپ نمونه ها ندارند. با این جود بایستی طراحی پرایمر به گونه ای صورت گیرد تا هیچ باند غیر اختصاصی در مرحله PCR و همچنین جایگاه غیر اختصاصی در مرحله هضم آنزیمی وجود نداشته باشد.

3) در نظر گرفتن جایگاه اسنیپ و انتخاب آنزیم برشی مورد نظر بایستی به گونه ای باشد که جایگاه برشی آنزیم مورد استفاده محدوده اسنیپ را پوشش دهد تا امکان تعیین ژنوتیپ وجود داشته باشد. بعلاوه محصول PCR بایستی فقط محتوی جایگاه برش اختصاصی (محتوی اسنیپ مذکور) باشد و در صورت وجود جایگاه برش غیر اختصاصی ما شاهد ایجاد باندهای غیر اختصاصی خواهیم بود.

4) انجام هضم آنزیمی توسط هر آنزیم اختصاصی مربوطه شرایط خاص خود را دارد به طوری که شرایط عمل هضم آنزیمی در زمان و دمای خاص صورت میگیرد. برای آنزیم های برشی که بهینه دمایی هضم آن ها بالا است بایستی از روغن PCR برای جلوگیری از تبخیر محتویات میکروتیوب استفاده گردد.