مایکوپلاسماها گروهی از باکتریهای بدون دیواره سلولی هستند که به دلیل ویژگیهای منحصربهفرد خود، مانند اندازه کوچک، عدم وجود دیواره سلولی و نیازهای متابولیک پیچیده، از سایر باکتریها متمایز میشوند. این خصوصیات، تشخیص مایکوپلاسما را در آزمایشگاهها به چالشی جدی تبدیل کرده است. در این مقاله، به بررسی روشهای مختلف شناسایی مایکوپلاسما میپردازیم، از جمله روشهای مبتنی بر کشت، مولکولی، سریع غیرمولکولی و رویکردهای نوین. هدف از این بررسی، ارائه دیدگاهی جامع بر مزایا، محدودیتها و کاربردهای هر روش است تا انتخاب رویکرد مناسب بر اساس نوع نمونه و شرایط تسهیل شود.
۱. روشهای مبتنی بر کشت
روشهای کشت، از قدیمیترین و سنتیترین رویکردها برای تشخیص مایکوپلاسما محسوب میشوند. این روشها بر پایه رشد باکتری در محیطهای خاص استوار هستند، اما به دلیل سرعت رشد پایین مایکوپلاسما، زمانبر هستند.
۱.۱. کشت استاندارد مایکوپلاسما
کشت مایکوپلاسما معمولاً در محیطهای اختصاصی مانند PPLO (Pleuropneumonia-Like Organisms) یا SP4 انجام میشود. این محیطها حاوی مواد مغذی خاصی مانند سرم اسب یا کلسترول هستند که برای رشد مایکوپلاسما ضروریاند. فرآیند کشت در شرایط کنترلشده (مانند دمای ۳۷ درجه سانتیگراد و جو ۵ درصد CO₂) صورت میگیرد و ممکن است چند روز تا چند هفته طول بکشد. این روش برای شناسایی مایکوپلاسماهای زنده و قابل تکثیر مناسب است، اما نمیتواند موارد غیرفعال یا مرده را تشخیص دهد.
۱.۲. تشخیص با استفاده از ویژگیهای مورفولوژیک
در کشتهای موفق، کلونیهای مایکوپلاسما اغلب به شکل “تخم مرغ سرخشده” (fried egg appearance) ظاهر میشوند، جایی که مرکز کلونی متراکم و حاشیه آن شفاف است. این ویژگی با استفاده از میکروسکوپ نوری یا استریومیکروسکوپ قابل مشاهده است. رنگ کلونیها معمولاً شفاف یا نیمهشفاف است و ساختار سطحی آنها میتواند برای تمایز گونهها مفید باشد. با این حال، شناسایی صرفاً بر اساس مورفولوژی ممکن است دقیق نباشد و نیاز به تأییدهای اضافی دارد.
۱.۳. محدودیتها و چالشها
- زمانبر بودن: نتایج ممکن است چند روز تا هفتهها طول بکشد.
- عدم تشخیص مایکوپلاسماهای غیرتکثیرشونده یا مرده: این روش تنها باکتریهای زنده را شناسایی میکند.
- نیاز به تجهیزات خاص: محیطهای کشت اختصاصی و شرایط کنترلشده ضروری هستند.
- حساسیت پایین: آلودگیهای باکتریایی دیگر میتواند نتایج را مختل کند.
از نظر علمی، روش کشت همچنان به عنوان “استاندارد طلایی” برای تأیید حضور مایکوپلاسما زنده شناخته میشود، اما برای کاربردهای سریع، روشهای مولکولی ترجیح داده میشوند.
۲. روشهای مولکولی
روشهای مولکولی بر پایه تشخیص DNA یا RNA مایکوپلاسما استوار هستند و حساسیت و سرعت بالایی دارند. این رویکردها حتی مایکوپلاسماهای مرده یا غیرفعال را شناسایی میکنند، که مزیت بزرگی نسبت به روشهای کشت است. تست مایکوپلاسما Realtime PCR امروزه گلد استاندارد مایکوپلاسما در صنایع دارویی است.
۲.۱. PCR (واکنش زنجیرهای پلیمراز)
PCR با استفاده از پرایمرهای اختصاصی برای ژنهای خاص مایکوپلاسما (مانند ۱۶S rRNA)، DNA را تکثیر و شناسایی میکند. این روش سریع (چند ساعت) و حساس است و میتواند مقادیر کم DNA را تشخیص دهد. PCR استاندارد برای تشخیص اولیه مناسب است، اما برای量化 نیاز به روشهای پیشرفتهتری دارد.
۲.۲. Real-Time PCR
این روش، که به qPCR نیز شناخته میشود، تکثیر DNA را به صورت واقعیزمان نظارت میکند و با استفاده از پروبهای فلورسنت، نتایج را کمی میکند. حساسیت آن بالاتر از PCR سنتی است و میتواند در کمتر از دو ساعت نتیجه دهد. Real-Time PCR برای تشخیص مایکوپلاسماهای مرده بسیار مفید است و در آزمایشگاههای بالینی رایج است.
۲.۳. تکنیکهای توالییابی (Sequencing)
توالییابی DNA، مانند Sanger یا NGS (Next-Generation Sequencing)، امکان شناسایی دقیق گونهها و حتی جهشها را فراهم میکند. این روش برای تمایز بین گونههای مختلف مایکوپلاسما (مانند M. pneumoniae و M. genitalium) ایدهآل است و میتواند بقایای DNA از باکتریهای مرده را تشخیص دهد. هزینه بالاتر آن، محدودیت اصلی است.
۲.۴. روشهای مبتنی بر هیبریداسیون
این روشها شامل Southern blot یا FISH هستند که از پروبهای DNA برای اتصال به توالیهای خاص مایکوپلاسما استفاده میکنند. FISH برای تشخیص in situ در بافتها مفید است و دقت بالایی در شناسایی RNA یا DNA دارد.
از نظر علمی، روشهای مولکولی مانند PCR و Real-Time PCR به دلیل دقت بالا و توانایی تشخیص DNA مرده، در بررسیهای اخیر به عنوان روشهای برتر توصیه شدهاند.
۳. روشهای سریع و غیرمولکولی
این روشها برای تشخیص سریع در محل مناسب هستند و نیاز به تجهیزات پیچیده ندارند.
۳.۱. تستهای ایمونوکروماتوگرافی
این تستها، شبیه به تستهای بارداری، از آنتیبادیهای اختصاصی برای تشخیص پروتئینهای سطحی مایکوپلاسما استفاده میکنند. نتایج در ۱۵-۳۰ دقیقه آماده میشود و برای نمونههای بالینی مانند خون یا سواب تنفسی کاربرد دارد. حساسیت آن متوسط است و ممکن است برای موارد کمتعداد دقیق نباشد.
۳.۲. روشهای سنجش فعالیت آنزیمی
این رویکردها فعالیت آنزیمهایی مانند آدنوزین فسفاتاز یا بتا-گلوکوزیداز را در مایکوپلاسما اندازهگیری میکنند. تستهای تجاری مانند MycoAlert بر این پایه استوار هستند و نتایج سریع ارائه میدهند.
۴. روشهای نوین و پیشرفته
رویکردهای نوین بر فناوریهای پیشرفته تمرکز دارند تا سرعت و دقت را افزایش دهند.
۴.۱. استفاده از نانوتکنولوژی
نانوذرات (مانند نانوذرات طلا یا مغناطیسی) میتوانند به مایکوپلاسما متصل شوند و با روشهای نوری یا مغناطیسی تشخیص داده شوند. این روش برای تشخیص point-of-care ایدهآل است و حتی مایکوپلاسماهای مرده را شناسایی میکند.
۴.۲. فناوریهای میکروفلوئیدیک
دستگاههای میکروفلوئیدیک حجمهای کوچک نمونه را پردازش میکنند و با ترکیب PCR یا ایمونواسی، تشخیص سریع (کمتر از یک ساعت) ارائه میدهند. این فناوری برای مناطق دورافتاده مناسب است و دقت بالایی دارد.
۵. نتیجهگیری
تشخیص مایکوپلاسما با روشهای متنوعی امکانپذیر است، از کشت سنتی تا رویکردهای مولکولی و نوین. روشهای کشت برای تأیید زنده بودن باکتری مناسباند، در حالی که روشهای مولکولی مانند PCR و Real-Time PCR برای تشخیص سریع و دقیق DNA مرده ترجیح داده میشوند. روشهای نوین مانند نانوتکنولوژی و میکروفلوئیدیک آینده تشخیص را شکل میدهند. انتخاب روش باید بر اساس نوع نمونه، زمان در دسترس و منابع انجام شود تا دقت حداکثری حاصل گردد. تحقیقات اخیر نشاندهنده پیشرفت در ترکیب روشها (مانند LAMP-CRISPR) برای بهبود حساسیت است.
