یکی از سوالاتی که به مراتب در ذهن پژوهشگران وجود دارد این است که چرا با پرایمر ساخت یک کمپانی جواب خوبی میگیرند اما با پرایمر ساخت کمپانی دیگر جواب خوبی نمیگیرند. به عبارت دیگر تفاوت در کیفیت پرایمر چه معنی دارد.
پرایمر یک اولیگو نوکلئوتید با ساختار کاملا مشخص است. وقتی ساختار کاملا مشخص است، کیفیت در ساختار نمیتواند تاثیری بگذارد. به عبارت دیگر توالی ATCGTGCGCGT تولید شده در کره و چین و آمریکا و ایران کاملا یکسان است. اما نکته حائز اهمیت این است که در محلول شما تمامی پرایمرها کامل نیستند. مقدار پرایمرهای ناتمام است که مشخص کننده کیفیت پرایمر تولیدی توسط یک کمپانی است. در ادامه در مورد اولیگوهای ناتمام صحبت میکنیم. ابتدا به صورت کوتاه فرایند سنتز را توضیح میدهم.
فرایند سنتز پرایمر
1. آغاز سنتز
- امتداد دهنده (Linker) و بستر ثابت (Solid support): سنتز با متصل کردن نوکلئوتید اولیه به یک بستر ثابت آغاز میشود. این بستر معمولاً یک رزین یا یک سطح جامد است که میتواند نوکلئوتیدها را به خود ببندد. این امر اجازه میدهد که واکنش‌های بعدی در فاز جامد انجام شوند، که تسهیل در جداسازی و تمیز کاری را فراهم میکند. بستر ثابت با توجه به اولین نوکلئوتید سمت 3 پرایمر شما انتخاب میشود. شما میتوانید بستر A یا T یا C یا G به واکنش خود وارد کنید.
2. مراحل دوره‌ای اضافه کردن نوکلئوتید
- Detritylation: حذف گروه محافظتی از نوکلئوتیدی که به بستر متصل است تا یک گروه هیدروکسیل آزاد برای واکنش بعدی فراهم شود.
- Activation and Coupling: نوکلئوتید بعدی که یک گروه محافظتی دارد و با یک فعال‌کننده شیمیایی ترکیب شده است، به گروه هیدروکسیل آزاد اضافه میشود. این واکنش به اتصال کووالانسی نوکلئوتید جدید به زنجیره رو به رشد منجر میشود.
- Capping: هر گروه هیدروکسیل آزاد که به نوکلئوتید جدید واکنش نداده است، مسدود میشود تا از واکنش‌های ناخواسته در مراحل بعدی جلوگیری شود.
- Oxidation: این مرحله برای استحکام بخشیدن به پیوندهای فسفودی‌استر ایجاد شده بین نوکلئوتیدها ضروری است.
3. تکرار چرخه
این چرخه‌های detritylation، activation/coupling، capping و oxidation برای هر نوکلئوتید جدید تکرار میشوند تا تمام توالی مورد نظر سنتز شود.
4. پایان سنتز و تمیزکاری
- جداسازی از بستر: پس از اتمام سنتز، زنجیره اولیگونوکلئوتیدی از بستر جامد جدا میشود.
- حذف گروه‌های محافظتی: گروه‌های محافظتی از نوکلئوتیدها حذف میشوند تا مولکول نهایی آزاد و فعال شود.
- تصفیه: به صورت پیش فرض اولین مرحله تصفیه حذف نمک های اضافه و سایر ترکیبات واکنش از مخلوط پرایمرهاست.
اولیگوهای ناتمام
در فرایند سنتز پرایمر بعد از فعال شدن انتهای اولیگو، نوکلئوزیدها به محیط آزمایش وارد میشوند. به عنوان مثال اگر قرار است اولیگو ATGCACG باشد، اولیگو اولیه که به بستر متصل است A است. بعد از آن T به محیط اضافه میشود. در این حالت انتهای فعال برای متصل شده T به A وجود دارد. بعد از انجام اتصال، برای جلوگیری از مشکلات بعدی مرحله capping انجام میشود. نتیجه این مرحله تعدادی AT و تعدادی A متصل نشده غیر فعال شده است. در مرحله بعدی بعد از Detritylation، تمام AT ها فعال میشوند اما A های بلاک شده تغییری نمیکنند. حال زمان ورود G است. در این مرحله هم حاصل کار AT و ATG است. مرحله بعدی … در نهایت ترکیب سنتز شده تحویل شده به ما به صورت زیر است:
A
AT
ATG
ATGC
ATGCA
ATGCAC
ATGCACG
گفته میشود بهترین درصد اتصال قابل دست یابی در حدود 98.5 درصد است.
تصور کنید که شما درخواست سنتز پرایمر داده اید. سوال اول از شما این است که غلظت پرایمر به مول چقدر باشد. اگر دقت کنید در فرم عبارت “Synthesis Scale” نوشته شده است. عموما مقیاس سنتز به نانومول بوده و 25 ، 100 و 250 نانومول است.
مقیاس سنتز یا Synthesis Scale مقدار اولین نوکلئوتید را برای ما مشخص میکند. به عبارت دیگر در مثال قبلی ، شما 25 نانومول از A را وارد محیط خواهید کرد.
در ادامه 98.5 درصد از آن AT میشوند.
برای یک اولیگو 20 نوکلئوتیدی که با بازده کوپلینگ 98 درصد ساخته شده و در مقیاس سنتز 25 نانومول، تقریباً 16.69 نانومول پرایمر کامل خواهید داشت. بنابراین، حدود 8.31 نانومول از پرایمرها به صورت ناتمام باقی می‌مانند.
برای قطعه بلندتر محاسبات جالب تر میشود :
برای یک اولیگو 30 نوکلئوتیدی که با بازده کوپلینگ 98 درصد ساخته شده و در مقیاس سنتز 25 نانومول، تقریباً 13.64 نانومول پرایمر کامل خواهید داشت. بنابراین، حدود 11.36 نانومول از پرایمرها به صورت ناتمام باقی می‌مانند.
دقت کنید 98.5 بالاترین بازده صنعتی هست. تصور کنید یک کمپانی بازده 95 درصد دارد :
با کاهش بازده کوپلینگ به 95 درصد برای یک اولیگو 30 نوکلئوتیدی در مقیاس سنتز 25 نانومول، تقریباً 5.37 نانومول پرایمر کامل خواهید داشت. این بدان معناست که حدود 19.63 نانومول از پرایمرها به صورت ناتمام باقی می‌مانند، که نشان دهنده افزایش قابل توجهی در میزان پرایمرهای ناتمام به دلیل کاهش بازده است.
حال تصور کنید که کیفیت کار یک کمپانی پایین است و از نوکلئوزیدهای بی کیفیت استفاده میکند و به همین دلیل بازده به 90 درصد کاهش پیدا کرده. با بازده کوپلینگ 90 درصد برای یک اولیگو 30 نوکلئوتیدی در مقیاس سنتز 25 نانومول، تقریباً 1.06 نانومول پرایمر کامل خواهید داشت.
در این حالت شما پرایمری را دریافت میکنید که روی آن غلظت 25 نانومول نوشته شده و OD قابل توجهی هم دارد اما شما عملا مخلوطی از پرایمرهایی را دارید که فرایند آغاز سنتز را در PCR شما انجام نمیدهند.
نقش پرایمرهای ناتمام در PCR
شما مخلوط پرایمرهای کامل و ناتمام خود را به عنوان پرایمر از شرکت سنتز کننده دریافت میکنید و این ترکیب را به PCR خود اضافه میکنید. در روش سنتز شیمیایی، پرایمر از سمت 3 به 5 سنتز میشود. ما همیشه تعداد قابل توجهی پرایمر ناقص داریم که در مرحله ای از سنتز متوقف شده اند. مشخصا انتهای 3 ما در تمام پرایمرها یکسان است. پس هر قطعه ای بتواند به DNA متصل بشود میتواند الگوی PCR شود. بنابراین ممکن است محصول PCR ما حاصل پرایمرهای مختلفی باشد. به عبارتی محصول PCR ما دارای طول های مختلفی ( با اختلاف یک یا دو نوکلئوتید ) باشد.
در مرحله اتصال رقابتی عجیب در اتصال وجود دارد. رقابت بین تعداد زیادی پرایمر ناتمام و پرایمر اصلی ما. دماهای پایین مرحله Annealing فرصت را به پرایمرهای ناتمام میدهد تا الگوی PCR شوند.
دلیل عدم موفقیت کلونینگ
شما یک پرایمر طراحی کرده اید. در سمت 3 پرایمر بخش اتصالی قرار دارد. فرض بر اینکه شما در طراحی خود در سمت 5 پرایمر یک بخش اضافه قرار داده اید که نقطه برش آنزیمی شماست. بخش برش آنزیمی به صورت آویزان بوده و به رشته الگو متصل نمیشود. اما به این دقت ندارید که درصد قابل توجهی از پرایمرهایی که دریافت کرده اید این بخش را در خود ندارند !!! و راحت تر از پرایمر اصلی شما به الگو متصل میشوند.
پس محصول نهایی PCR شما مخلوطی عجیب از رشته هایی است که قطعه مورد نظر شما را ندارند و رشته هایی که توالی مورد نظر شما را دارند. و دلیل عدم موفقیت کلونینگ شما یا نیاز به تلاش بسیار زیاد برای برش و اتصال این است.
راه حل چیست ؟
یک کلمه : استفاده از تخلیص
به جرات میتوانم بگویم که 90 درصد پژوهشگران از انواع روش های تخلیص پرایمر مطلع نیستند. شرکت های سنتز کننده به شما این امکان را میدهند که با استفاده از روش هایی مثل HPLC و PAGE درصد خلوص محصول نهایی خود را بالا ببرید.
