اگزوزوم های بزاق | کاربرد، استخراج و ویژگی ها

اگزوزوم بزاق یا Salivary Exosomes یکی از انواع اگزوزوم ها از نظر منشا استخراج است که شاید کمتر اسم آن را شنیده باشید. قاعدتا نام اگزوزوم پلاسما یا سرم، یا اگزوزوم های کشت سلولی را به فراوانی شنیده اید، اما باید بدانید که یکی دیگر از منابع استخراج اگزوزوم های انسانی بزاق است.

در مورد بزاق، اگزوزوم‌های موجود در بزاق (سالیواری اگزوزوم‌ها) می‌توانند نقش مهمی در حفاظت از دهان و نقاط دیگر بدن داشته باشند. این اگزوزوم‌ها حاوی مولکول‌هایی هستند که می‌توانند در فرایندهای ضد میکروبی، ترمیم زخم و حفاظت از بافت‌ها نقش داشته باشند. علاوه بر این، برخی تحقیقات نشان داده‌اند که اگزوزوم‌های بزاقی ممکن است در تشخیص بیماری‌ها مانند سرطان دهان و دیگر بیماری‌های سیستمیک مورد استفاده قرار گیرند.

مقدمه

بزاق که حاوی اطلاعات بیولوژیکی است، به عنوان یک ابزار تشخیصی ارزشمند برای بیماری ها و بیماری های موضعی و سیستمیک در نظر گرفته می شود، زیرا مانند خون حاوی مولکول های مهمی مانند DNA، RNA و پروتئین است. اگزوزوم ها وزیکول های مشتق شده از سلول به قطر 30 تا 100 نانومتر با عملکردهای بیولوژیکی قابل توجهی از جمله ارتباطات درون سلولی و سیگنال دهی هستند. این وزیکول ها که در مایعات بدن از جمله بزاق وجود دارند، پس از ادغام اجسام چند وزیکولی (MVBs) با غشای پلاسمایی سلولی آزاد می شوند. تشخیص بزاقی مزایای قابل توجهی دارد که شامل غیرتهاجمی بودن، سهولت جمع آوری، عدم انعقاد و محتوای مشابه پلاسما و همچنین افزایش پذیرش بیمار در مقایسه با سایر روش های تشخیصی است.

اگزوزوم بزاق

در حال حاضر، استفاده از بزاق به عنوان یک منبع تشخیصی توجه زیادی را به خود جلب کرده است. این منبع پر اهمیت، به سادگی به دست می آید و تهاجمی نیست و به سادگی میتوان نمونه بزاق فرد را دریافت کرد. به همین دلیل است که امروزه کمپانی های DTC ژنتیکی، از بزاق به عنوان منبع DNA استفاده میکنند. کیت استخراج DNA از بزاق و ست های نمونه گیری بزاق امروزه به فراوانی در بازار جهانی موجود هستند. بعلاوه، به دلیل تعامل فیزیکی بین بزاق و منابع خونی، محتویات بزاق مشابه پلاسما است. علاوه بر این، بزاق دارای مزایایی نسبت به خون است زیرا منعقد نمی شود، آسان به دست می آید و نگهداری آن ساده تر است. با این حال، استفاده از بزاق کامل دارای چندین معایب است، از جمله آلودگی، تنوع و وجود پروتئین هایی مانند آمیلاز که می تواند سایر پروتئین ها را با بیان کم بپوشاند و اختلال با باکتری ها و سایر ترکیبات غذایی باقی مانده در دهان.

تحقیقات قبلی نشان داده‌اند که اگزوزوم‌های حاوی پروتئین‌ها، miRNAها و mRNAها (RNA انتقالی اگزوزوم) در مایعات بدنی مختلف مانند پلاسما، ادرار، مایع آمنیوتیک و بزاق می‌توانند به عنوان یک پلتفرم جدید برای تشخیص عمل کنند. به ویژه، وزیکول‌های خارج سلولی (EVها) که توانایی عبور از موانع اپیتلیال مانند سد خونی-مغزی از طریق ترانس سیتوز را دارند. ماچیدا و همکارانش miR-1246 و miR-4644 را در اگزوزوم‌های بزاقی شناسایی کرده‌اند که در اگزوزوم‌های سرم به شدت بیان می‌شوند و به عنوان بیومارکرهای بالقوه سرطان مجاری پانکراس و صفراوی شناخته شده‌اند. علاوه بر این، بعضی از محققان در انسان‌ها نقش اگزوزوم‌ها را در دیگر مایعات بدنی مانند ادرار در بیماری‌های سیستمیک گزارش کرده‌اند. به عنوان مثال، مطالعه اگزوزوم‌های ادراری به بیماری‌های مرتبط با کلیه محدود شده است. بررسی نقش اگزوزوم‌های بزاقی و درک مکانیزم‌های تنظیم‌کننده آن‌ها در بیماری‌های سیستمیک می‌تواند بینش‌های جدیدی در مورد کاربردهای احتمالی آن‌ها در تشخیص و درمان غیرتهاجمی بیماری‌های سیستمیک فراهم آورد.

ویژگی اگزوزوم های بزاق

اگزوزوم‌های بزاقی، مانند اگزوزوم‌های دیگر مایعات بدن، وزیکول‌های گرد هستند که قطر متوسط آن‌ها بین ۳۰ تا ۱۰۰ نانومتر است و سطح آن‌ها دارای مارکر ایمونولوژیک CD63 است. بر اساس اندازه و ترکیب پروتئینی منحصر به فردشان، اگزوزوم‌های بزاقی در بزاق کامل به دو نوع، اگزوزوم‌های نوع I و II، تقسیم‌بندی می‌شوند. قطر متوسط اگزوزوم‌های نوع I حدود ۸۳.۵ نانومتر و اگزوزوم‌های نوع II حدود ۴۰.۵ نانومتر است. هر دو نوع حاوی بیومارکرهای اگزوزومی هستند، از جمله Alix، ژن حساس به تومور ۱۰۱ (TSG101) و پروتئین شوک حرارتی (HSP)، و همچنین حاوی ایمونوگلوبولین (Ig) A و گیرنده پلیمریک Ig هستند. در اگزوزوم‌های نوع I و II به ترتیب ۱۰۱ و ۱۵۴ پروتئین شناسایی شده‌اند که ۶۸ پروتئین با نشانگرهای مشترک بین دو گروه تداخل دارند. تقریباً ۴۰ درصد از این پروتئین‌ها پروتئین‌های ترشحی هستند، مانند آلبومین سرم یا پروتئین‌های خارج سلولی مانند زنجیره‌های Ig، که نشان می‌دهد اگزوزوم‌های بزاقی از لنفوسیت‌های گردشی و مایع داخل عروقی منشأ می‌گیرند. تنوع ساختاری اگزوزوم‌های بزاقی ممکن است نشان‌دهنده منشأ مختلف آن‌ها از قسمت‌های متفاوت غدد بزاقی باشد. به عنوان مثال، galectin-3-binding protein تنها روی سلول‌های اپیتلیال مجرایی و pIgR عمدتاً در سلول‌های اپیتلیال آسینار و مجرایی موضعی شده‌اند. Ogawa و همکارانش اگزوزوم‌های نوع I و II را در موش‌های مختلف کاشته و مشاهده کردند که موش‌هایی که با اگزوزوم‌های نوع II کاشته شده‌اند، پاسخ ایمنی قوی‌تری به DPP IV نشان دادند، که نشان‌دهنده ایمنی‌زایی بهتر اگزوزوم‌های نوع II است. همچنین گزارش شده است که بزاق می‌تواند فاکتور هفت‌محور انعقادی پلاسمای انسان را فعال کند و اگزوزوم‌های بزاقی زمان لخته‌سازی پلاسمای فاقد اگزوزوم را به طور قابل توجهی کاهش دهند.

ترکیب اگزوزوم‌های بزاقی

ترشح ریبونوکلئوپروتئین‌ها، که آنتی ژن‌های ایمنی درگیر در بیماری‌های روماتیسمی سیستماتیک در اگزوزوم‌های سلول‌های اپیتلیال غیرنئوپلاستیک غدد بزاقی هستند، اولین بار در سال ۲۰۰۵ شناسایی شد. استفاده ترکیبی از میکروسکوپی الکترونی، ایمونوبلاتینگ و تکنیک‌های ایمونوپرسیپیتیشن منجر به شناسایی تعداد زیادی اگزوزوم بزاقی شده است. گونزالس و همکاران با استفاده از تکنولوژی شناسایی پروتئین چندبعدی (MudPIT) ۴۹۱ پروتئین را در بخش اگزوزوم بزاق پاروتید انسان فهرست‌بندی کردند. از این پروتئین‌ها، ۲۶۵ مورد در بزاق مجرایی از غدد پاروتید مشاهده شده و ۷۲ پروتئین با پروتئین‌های اگزوزوم ادرار همپوشانی داشتند که نشان‌دهنده شباهت‌هایی در اگزوزوم‌های با منشأ مختلف است. اوگاوا و همکارانش DPP IV، گالکتین-۳ و IgA را شناسایی کردند که ممکن است بر پاسخ ایمنی تأثیر بگذارند. DPP IV در وزیکول‌ها فعال بوده و باعث شکستن سوبستانس P و پلی‌پپتید انسولینوتروپیک وابسته به گلوکز می‌شود که نشان‌دهنده نقش اگزوزوم‌های بزاقی در کاتابولیسم پپتیدهای بیواکتیو و نقش تنظیمی آن‌ها در پاسخ ایمنی موضعی در حفره دهان است. پروتئین‌های غشایی اگزوزومی مانند CD9، CD63، CD81 و همچنین پروتئین‌های داخل سلولی مانند HSP70 و TSG101 به عنوان نشانگرهای اگزوزوم شناخته شده‌اند. اگزوزوم‌های بزاقی همچنین حاوی انواع RNAها هستند، که بیشتر آن‌ها RNAهای کوچک هستند. به دلیل اندازه کوچک RNAهای غیرکدکننده (ncRNAs)، این مولکول‌ها نسبت به mRNAها در برابر تخریب توسط ریبونوکلئازها کمتر آسیب‌پذیر هستند و بنابراین بسیار پایدارتر هستند. گزارش شده است که miRNAهای بزاقی و RNAهای تعاملی PIWI (piRNAs) عمدتاً در اگزوزوم‌ها یافت می‌شوند. باهن و همکاران با استفاده از توالی‌سنجی RNA با کارایی بالا دریافتند که انواع فراوان RNAهای کوچک در بزاق انسان بدون سلول شامل RNAهای تعاملی Piwi، miRNAها و RNAهای کوچک نوکلئولار است که به ترتیب ۷.۵٪، ۶.۰٪ و ۰.۰۲٪ از کل RNAهای کوچک را تشکیل می‌دهند. بنابراین، RNAهای غیرکدکننده به طور گسترده‌ای به عنوان تنظیم‌کننده‌های توابع بیولوژیکی متنوع مورد بررسی قرار گرفته‌اند. اوگاوا و همکاران با استفاده از تکنولوژی توالی‌سنجی نسل بعدی، ترکیبات RNAهای کدکننده پروتئین و RNAهای بلند غیرپروتئینی در اگزوزوم‌ها و بزاق کامل را بررسی کردند. نتایج نشان داد که اگزوزوم‌های I و II و WS به طور متفاوتی miRNAها را بیان می‌کنند و بیشتر miRNAهای بیان شده در WS در اگزوزوم‌ها بیان نمی‌شوند. در اگزوزوم‌ها، یک جزء از کمپلکس سکوت‌کننده RNA تحت تأثیر GW182 برای پایداری RNAهای اگزوزومی مهم است. در اگزوزوم‌های I و II و WS، miRNA hsa-mir-378 با بقای سلولی، رشد تومور و آنژیوپویزیس ارتباط دارد. گالو و همکاران گزارش کرده‌اند که miR-22، miR-202 و miR-1237d در اگزوزوم‌های بزاقی غالب هستند. با این حال، عملکردها و مکانیزم‌های خاص این RNAهای اگزوزومی نیاز به بررسی بیشتر دارند.

جداسازی و استخراج اگزوزوم از بزاق

روش‌های مختلفی برای جداسازی اگزوزوم‌ها از بزاق توصیف شده‌اند که شامل سانتریفوژ دیفرانسیل، سانتریفوژ گرادیان چگالی، کروماتوگرافی استثنا قطر، فیلتراسیون، رسوب‌گذاری بر پایه پلیمر، جداسازی ایمونولوژیکی و کیت‌های تجاری جداسازی اگزوزوم می‌شوند. دو روش اصلی برای جداسازی اگزوزوم‌های بزاقی وجود دارد: روش فیزیکی کلاسیک التراسانتریفوژ (UC) و ExoQuick-TC™ (EQ)، یک عامل شیمیایی طراحی شده برای رسوب اگزوزوم‌ها. استخراج اگزوزوم‌ها از مواد بیولوژیکی به دلیل آسانی آلودگی با پروتئین‌های غیر اگزوزومی و تخلیه ممکن اگزوزوم‌ها توسط غشاء سلولی، فنی سخت است. UC معمولاً پلت‌های اگزوزومی با آلودگی کمتری به دست می‌دهد، اما این فرآیند پیچیده و طولانی است و نیازمند تجهیزات تخصصی است. هنگامی که EQ با بزاق ترکیب می‌شود، اگزوزوم‌های سالم به دست می‌آیند و این روش برای رسوب اگزوزوم‌های بزاقی از حجم‌های کم بزاق مناسب و کارآمد است. با این حال، EQ معمولاً با ناخالصی‌های بیولوژیکی بیشتری (پروتئین‌ها/میکرووزیکول‌های مرتبط با غیر اگزوزوم) نسبت به UC همراه است.

پس از جداسازی، از میکروسکوپ الکترونی ترانسمیشن برای شناسایی اگزوزوم‌های خاص که دارای مورفولوژی “شکل فنجان” توصیف شده‌اند، استفاده می‌شود. علاوه بر این، با استفاده از تکنیک حساس فوق‌العاده میکروسکوپی نیروی اتمی کم قدرت، ساختار، شیمی و مکانیک اگزوزوم‌ها قابل بررسی است. همچنین، در گرادیان‌های مداوم ساکارز، اگزوزوم‌ها در چگالی‌های بین ۱.۱۳ تا ۱.۱۹ گرم بر میلی‌لیتر تعادل می‌یابند. نشانگرهای خاص اگزوزوم برای مشخص کردن اگزوزوم‌ها و تمایز آن‌ها از دیگر EVها مهم هستند. با این حال، توسعه تکنیک‌های نوین برای مطالعه اگزوزوم‌ها ضروری است و این کمک می‌کند در کشف بیومارکرهای اگزوزومی اضافی و استفاده آن‌ها در تشخیص بیماری‌های مختلف.