hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) چیست و چه کاربردهایی دارد

در دهه‌های اخیر، تکنیک‌های جداسازی و تحلیل مواد شیمیایی به سرعت پیشرفت کرده‌اند و به عنوان ابزارهای اساسی در زمینه‌های مختلف علمی مانند داروسازی، زیست‌شناسی، شیمی تجزیه و محیط زیست به کار رفته‌اند. یکی از این تکنیک‌های پیشرفته، هیدروفیلیک اینتراکشن لیکوید کروماتوگرافی (HILIC) است که به عنوان یک روش جداسازی مکمل و موثر برای ترکیبات قطبی و هیدروفیلیک معرفی شده است.

HILIC یک تکنیک کروماتوگرافی مایع است که از فاز ثابت قطبی و فاز متحرک نسبتاً غیر قطبی استفاده می‌کند. این روش، تعاملات هیدروفیلیک بین ترکیبات نمونه و فاز ثابت را به عنوان مکانیزم اصلی جداسازی بهره می‌برد. HILIC برای جداسازی ترکیباتی که در روش‌های کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) فاز معکوس نمی‌توانند به خوبی جدا شوند، مناسب است.

در این مقاله، ما ابتدا به مروری بر اصول اساسی HILIC می‌پردازیم و سپس به بررسی انواع ستون‌های موجود برای این روش از جمله ستون‌های زیتریونیک (ZIC-HILIC)، آمیدی (Amide HILIC) و سیلیکا (Silica HILIC) می‌پردازیم. همچنین، مزایا و محدودیت‌های این روش و کاربردهای آن در زمینه‌های مختلف علمی مورد بحث قرار می‌گیرد. در نهایت، نمونه‌هایی از بهینه‌سازی روش HILIC برای کاربردهای خاص و روندهای جدید و پیشرفت‌های اخیر در تکنیک HILIC معرفی می‌شوند.

با توجه به افزایش تقاضا برای جداسازی و تحلیل ترکیبات قطبی در زمینه‌های مختلف، مانند متابولومیکس، پروتئومیکس، تحلیل داروها و مواد طبیعی، اهمیت کاربرد HILIC در این زمینه‌ها روز به روز افزایش می‌یابد. در این بخش، به بررسی کاربردهای کلیدی HILIC در این زمینه‌ها و روش‌های بهینه‌سازی جهت حصول نتایج بهتر پرداخته می‌شود.

به علاوه، توجه به توسعه ستون‌های جدید HILIC با کارایی بالاتر و طول عمر طولانی‌تر، مانند ستون‌های پایدار در برابر پوسیدگی (high-stability columns) و ستون‌های کم تفکیک‌پذیر (core-shell columns)، می‌تواند به کارایی بیشتر در تحلیل‌های ترکیبات قطبی منجر شود.

در نهایت، به بررسی ادغام HILIC با سایر تکنیک‌های جداسازی، مانند کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا فاز معکوس (RP-HPLC) یا کروماتوگرافی یون‌گیر (IEC)، برای تحلیل‌های بیشتر پیچیده و دست‌یابی به جداسازی موثرتر ترکیبات با خصوصیات متنوع پرداخته می‌شود.

تفاوت HILIC و کروماتوگرافی فاز نرمال

HILIC (کروماتوگرافی مایع مبتنی بر تعامل هیدروفیلیک معکوس) و کروماتوگرافی فاز نرمال (Normal Phase HPLC) دو روش جداسازی مایع متفاوت با مکانیزم جدایی و فازهای ثابت و متحرک متفاوت هستند. در زیر تفاوت‌های اصلی بین HILIC و کروماتوگرافی فاز نرمال را بررسی خواهیم کرد:

1. فاز ثابت: در کروماتوگرافی فاز نرمال، فاز ثابت معمولاً یک ماده هیدروفوبیک مانند سیلیکا یا آلومینا است، در حالی که در HILIC، فاز ثابت معمولاً یک ماده هیدروفیلیک مانند سیلیکا با پوشش هیدروکسیل یا آمینو است.
2. فاز متحرک: در کروماتوگرافی فاز نرمال، فاز متحرک معمولاً یک حلال قطبی مانند آب یا الکل است، در حالی که در HILIC، فاز متحرک معمولاً یک مخلوط از آب و حلال آلی مانند آسیتونیتریل یا متانول با افزودن عوامل نگهدارنده قطبی مانند نمک‌ها و بافرها است.
3. مکانیزم جداسازی: در کروماتوگرافی فاز نرمال، جداسازی بر اساس تفاوت پلاری بین فاز ثابت و متحرک اتفاق می‌افتد و ترکیبات پلارتر بیشتر بر روی فاز ثابت نگهداری می‌شوند. در HILIC، جداسازی بر اساس تعاملات هیدروفیلیک بین فاز ثابت و متحرک اتفاق می‌افتد و ترکیبات پلار یا هیدروفیلیک بیشتر بر روی فاز ثابت نگهداری می‌شوند.
4. نوع آنالیت: در کروماتوگرافی فاز نرمال، جایی برای جداسازی ترکیبات غیر قطبی و هیدروفوبیک مانند لیپیدها وجود دارد، در حالی که HILIC برای جداسازی ترکیبات پلار و هیدروفیلیک مانند متابولیت‌های پلار، آمینو اسیدها، قندها و غیره مناسب‌تر است.
5. کاربردها: کروماتوگرافی فاز نرمال عمدتاً برای جداسازی و تحلیل محصولات طبیعی، لیپیدها و ویتامین‌های قابل حل در چربی استفاده می‌شود، در حالی که HILIC عمدتاً برای تجزیه و تحلیل متابولیت‌های پلار، آمینو اسیدها، کربوهیدرات‌ها و ترکیبات هیدروفیلیک دیگر استفاده می‌شود.

به طور خلاصه، انتخاب بین HILIC و کروماتوگرافی فاز نرمال بستگی به ویژگی‌های خاص آنالیت‌ها و هدف جداسازی دارد. کروماتوگرافی فاز نرمال برای ترکیبات غیر قطبی و هیدروفوبیک مناسب تر است، در حالی که HILIC برای ترکیبات پلار و هیدروفیلیک مناسب تر است.

تفاوت HILIC و کروماتوگرافی فاز معکوس

کروماتوگرافی فاز معکوس (RP-HPLC) و HILIC (Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography) دو روش جداسازی مایع متفاوت با فازهای ثابت و متحرک متفاوت هستند. در زیر تفاوت‌های اصلی بین RP-HPLC و HILIC را بررسی خواهیم کرد:

1. فاز ثابت: در RP-HPLC، فاز ثابت معمولاً یک ماده هیدروفوبیک مانند سیلیکا با پوشش مانند سی 18 است، در حالی که در HILIC، فاز ثابت معمولاً یک ماده هیدروفیلیک مانند سیلیکا با پوشش هیدروکسیل یا آمینو است.
2. فاز متحرک: در RP-HPLC، فاز متحرک معمولاً یک حلال آلی مانند متانول یا آسیتونیتریل با آب است، در حالی که در HILIC، فاز متحرک معمولاً یک مخلوط آب و یک حلال آلی مانند آسیتونیتریل یا متانول است.
3. مکانیزم جداسازی: در RP-HPLC، جداسازی بر اساس تفاوت پلاری بین فاز ثابت و متحرک اتفاق می‌افتد و ترکیبات کمتر پلار بر روی فاز ثابت نگهداری می‌شوند. در HILIC، جداسازی بر اساس تعاملات هیدروفیلیک بین فاز ثابت و متحرک اتفاق می‌افتد و ترکیبات پلار بیشتر بر روی فاز ثابت نگهداری می‌شوند.
4. آنالیت‌های قابل تحلیل: در RP-HPLC، ترکیباتی مانند آمین‌ها، پپتیدها، پروتئین‌ها و مرکبات غیر پلار مناسب هستند، در حالی که در HILIC، ترکیبات پلاری مانند قندها، آمینو اسیدها، نوکلئوتیدها و متابولیت‌های کوچک پلار رایج هستند.
5. میزان تأثیر حلال آلی: در RP-HPLC، میزان تأثیر حلال آلی بر جداسازی بیشتر است و افزایش غلظت حلال آلی باعث کاهش ظرفیت و انتقال زمان جریان به سمت کوتاه‌تر می‌شود. در HILIC، افزایش غلظت حلال آلی باعث افزایش ظرفیت و انتقال زمان جریان به سمت بلندتر می‌شود.
6. استفاده در طیف وسیعی از کاربردها: هر دو RP-HPLC و HILIC در طیف وسیعی از کاربردها، از جمله تجزیه و تحلیل مواد مخدر، ترکیبات غذایی، داروها و ترکیبات طبیعی مورد استفاده قرار می‌گیرند.

بنابراین، با توجه به ویژگی‌های خاص آنالیت‌ها و هدف جداسازی، باید بین RP-HPLC و HILIC انتخاب شود. اگر آنالیت‌ها دارای خواص پلار و هیدروفیلیک هستند، HILIC بهترین انتخاب است، در حالی که در صورتی که آنالیت‌ها دارای خواص غیر پلار و هیدروفوبیک هستند، RP-HPLC بهترین انتخاب است.

انواع ستون HILIC

ستون‌های HILIC مختلفی وجود دارند که بر اساس نوع فاز ثابت و فاز متحرک، دسته‌بندی می‌شوند. در زیر، تفاوت‌های ستون‌های HILIC رایج را بررسی خواهیم کرد:

1. ستون‌های HILIC با فاز ثابت سیلیکا با پوشش هیدروکسیل (silica with hydroxyl group) – این نوع ستون HILIC معمولاً برای جداسازی موثر ترکیبات پلار و هیدروفیلیک مانند قندها، الکل‌ها، نوکلئوتیدها و آمینو اسیدها مناسب هستند.
2. ستون‌های HILIC با فاز ثابت سیلیکا با پوشش آمینو (silica with amino group) – این نوع ستون HILIC معمولاً برای جداسازی موثر ترکیبات پلار و هیدروفیلیک مانند پپتیدها، پروتئین‌ها، آمینو اسیدها و اوره مناسب هستند.
3. ستون‌های HILIC با فاز ثابت سلولز با پوشش آمینو (cellulose with amino group) – این نوع ستون HILIC برای جداسازی موثر ترکیبات پلار و هیدروفیلیک مانند کربوهیدراتها، قندها، الکل‌ها و گلیکوزامینوگلیکان‌ها مناسب هستند.
4. ستون‌های HILIC با فاز ثابت ZIC-HILIC (Zwitterionic Hydrophilic Interaction Chromatography) – این نوع ستون HILIC دارای فاز ثابتی با مشخصات زیترونیونیک هستند و برای جداسازی موثر ترکیبات پلار و هیدروفیلیک مانند پپتیدها، نوکلئوتیدها، قندها و متابولیت‌های کوچک پلار مناسب هستند.
5. ستون‌های HILIC با فاز ثابت Amide (امید) – این نوع ستون HILIC دارای فاز ثابت با پوشش امید است و برای جداسازی موثر ترکیبات پلار و هیدروفیلیک مانند اسیدهای آمینه، قندها، پپتیدها و نوکلئوتیدها مناسب هستند. این نوع ستون HILIC به دلیل قابلیت جداسازی بیشتر، کارایی بالاتر و تغییرات حساسیتی نسبت به تغییرات pH، پایداری و تکرارپذیری بالاتری دارند.

به طور خلاصه، انتخاب مناسب‌ترین نوع ستون HILIC برای تحلیل مورد نظر بستگی به ویژگی‌های شیمیایی و فیزیکی آنالیت‌ها و هدف جداسازی دارد. هر نوع ستون HILIC دارای ویژگی‌های منحصر به فردی است که برای جداسازی موثر ترکیبات پلار و هیدروفیلیک مورد استفاده قرار می‌گیرد.

ستون Amide

امید (Amide) یک گروه عاملی آلی با فرمول شیمیایی -CONH2 است. این گروه عاملی از یک اتم کربن، یک اتم اکسیژن، یک اتم نیتروژن و یک اتم هیدروژن تشکیل شده است.

در ستون‌های HILIC با فاز ثابت Amide، فاز ثابت با پوشش امیدی روی سطح ستون قرار دارد و به عنوان فاز متحرک، مخلوط آب و یک حلال آلی مانند آسیتونیتریل یا متانول استفاده می‌شود. این ستون‌ها برای جداسازی ترکیبات پلار و هیدروفیلیک مانند اسیدهای آمینه، قندها، پپتیدها، نوکلئوتیدها و متابولیت‌های کوچک پلار مناسب هستند.

همچنین، فاز ثابت Amide به عنوان یکی از فازهای ثابت HILIC، برای جداسازی ترکیبات پلار و هیدروفیلیک در کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا مورد استفاده قرار می‌گیرد.

ستون‌های HILIC با فاز ثابت Amide (امید) دارای فاز ثابت با پوشش امید هستند. این نوع ستون HILIC برای جداسازی موثر ترکیبات پلار و هیدروفیلیک مانند اسیدهای آمینه، قندها، پپتیدها، نوکلئوتیدها و متابولیت‌های کوچک پلار مناسب هستند.

ستون‌های HILIC با فاز ثابت Amide در برخی موارد به عنوان جایگزین HILIC با فاز ثابت سیلیکا با پوشش هیدروکسیل استفاده می‌شوند. در این نوع ستون‌ها، با پوشش امیدی که در سطح فاز ثابت قرار دارد، یک فاز پلار و هیدروفیلیک به وجود می‌آید.

ویژگی‌های ستون‌های HILIC با فاز ثابت Amide شامل دارا بودن ترکیبی از ویژگی‌های HILIC و کروماتوگرافی فاز معکوس است که این ویژگی‌ها باعث افزایش دقت و کارایی جداسازی در مقایسه با ستون‌های دیگر می‌شوند.

به طور کلی، استفاده از ستون‌های HILIC با فاز ثابت Amide برای جداسازی ترکیبات پلار و هیدروفیلیک، مخصوصاً در تحلیل نمونه‌های پیچیده و دشوار مانند نمونه‌های بیولوژیکی مفید است.

انواع ستون Amide

در حال حاضر چندین نوع ستون با فاز ثابت Amide در بازار موجود است که برخی از آن‌ها عبارتند از:

1. ستون XBridge BEH Amide: این ستون با فاز ثابت Amide متعلق به شرکت Waters است و برای جداسازی ترکیبات پلار و هیدروفیلیک، از جمله قندها، الکل‌ها، اسیدهای آمینه و نوکلئوتیدها استفاده می‌شود.
2. ستون Nucleodur HILIC Amide: این ستون با فاز ثابت Amide متعلق به شرکت Macherey-Nagel است و برای جداسازی ترکیبات پلار و هیدروفیلیک مناسب است، از جمله آمینو اسیدها، پپتیدها، قندها و نوکلئوتیدها.
3. ستون HALO HILIC Amide: این ستون با فاز ثابت Amide متعلق به شرکت Advanced Materials Technology است و برای جداسازی ترکیبات پلار و هیدروفیلیک، از جمله الکل‌ها، قندها و کربوهیدراتها، اسیدهای آمینه و نوکلئوتیدها استفاده می‌شود.
4. ستون TSKgel Amide-80: این ستون با فاز ثابت Amide متعلق به شرکت Tosoh Bioscience است و برای جداسازی ترکیبات پلار و هیدروفیلیک، از جمله پپتیدها، آمینو اسیدها و قندها استفاده می‌شود.
5. ستون ACQUITY UPLC HILIC Amide: این ستون با فاز ثابت Amide متعلق به شرکت Waters است و برای جداسازی ترکیبات پلار و هیدروفیلیک، از جمله پپتیدها، آمینو اسیدها و قندها استفاده می‌شود.
6. ستون ZIC-HILIC: این ستون با فاز ثابت زیرین‌پیوندی شیمیایی برای محیط حفظ شده است که باعث شده است که این ستون به عنوان یکی از محبوب ترین ستون‌های HILIC شناخته شود. این ستون در جداسازی ترکیبات پلار و هیدروفیلیک مؤثر است و از جمله کاربردهای آن می‌توان به جداسازی آمینو اسیدها، پپتیدها، نوکلئوتیدها و کربوهیدراتها اشاره کرد.
7. ستون HILIC-Z: این ستون با فاز ثابت HILIC زیرین‌پیوندی شیمیایی برای محیط حفظ شده است و برای جداسازی ترکیبات پلار و هیدروفیلیک، مانند آمینو اسیدها، پپتیدها، قندها و نوکلئوتیدها مناسب است.
8. ستون NUCLEOSHELL HILIC: این ستون با فاز ثابت HILIC و در پایه سیلیکا محیط حفظ شده است. این ستون برای جداسازی ترکیبات پلار و هیدروفیلیک، مانند الکل‌ها، قندها و نوکلئوتیدها مناسب است.
9. ستون SeQuant ZIC-cHILIC: این ستون با فاز ثابت زیرین‌پیوندی شیمیایی برای محیط حفظ شده است و برای جداسازی ترکیبات پلار و هیدروفیلیک، مانند آمینو اسیدها، پپتیدها، قندها و نوکلئوتیدها مناسب است.

در کل، با توجه به تنوع مواد غذایی و دارویی، استفاده از نوع مناسب ستون HILIC با فاز ثابت Amide می‌تواند به تحقیقات بیولوژیکی و شیمیایی کمک کند و در جداسازی ترکیبات پلار و هیدروفیلیک مؤثر باشد.

ستون کروماتوگرافی Zic-Hilic

ستون ZIC-HILIC نوعی ستون HILIC با فاز ثابت زیرین پیوندی است که توسط شرکت شیمیایی شماره یک در جهان در زمینه تحقیق، تولید و فروش ستون‌های کروماتوگرافی به نام “Merck” تولید می‌شود.

این ستون با فاز ثابت Zwitterionic ion exchange chromatography (ZIC) در حالت HILIC است و برای جداسازی ترکیبات پلار و هیدروفیلیک، مانند الکل‌ها، قندها، آمینو اسیدها، پپتیدها، نوکلئوتیدها و کربوهیدراتها مناسب است. فاز ثابت ZIC به عنوان یک فاز ثابت جدید در HILIC مطرح شده است و قابلیت جداسازی مناسبی برای مولکول‌های پلار دارد.

ستون ZIC-HILIC به دلیل داشتن گروه‌های زیرین‌پیوندی با مقادیر بار زیاد، ظرفیت بالا برای جذب و جداسازی ترکیبات پلار و هیدروفیلیک را دارد و همچنین باعث شده تا زمان ترکیب کوتاه‌تر و حساسیت بالاتری در تشخیص ترکیبات داشته باشد. برای این دلیل، ستون ZIC-HILIC به عنوان یکی از محبوب ترین ستون‌های HILIC شناخته شده است و برای بسیاری از کاربردهای آزمایشگاهی و صنعتی مورد استفاده قرار می‌گیرد.